Optimización de los protocolos de crioconservación de semen ovino de las razas autóctonas en peligro de extinción xisqueta y aranesa

Para optimizar la crioconservación de semen de morueco de las razas Xisqueta y Aranesa, se estudió utilizar otras alternativas a la yema de huevo fresca en la elaboración de los medios para reducir la heterogeneidad, contaminación microbiológica y algunos de sus componentes que interfieren negativamente en su capacidad crioprotectora, analizando diferentes tipos de yema de huevo (fresca, en polvo y clarificada), así como la eliminación del plasma seminal previamente a la conservación y la edad del donante. En segundo lugar, con el afán de elaborar diluyentes libres de crioprotectores de origen animal y de composición definida se analizó la eficacia de la lecitina de soja o el butil hidroxitolueno (BHT), combinados con glicerol o trehalosa, así como dos sistemas tampón, TRIS vs TEST, y la adición de BHT como antioxidante en la criosupervivencia espermática. Asimismo, se pretendió determinar la concentración óptima de BHT, estudiando simultáneamente el efecto de la presencia de plasma seminal en el diluyente. Finalmente, se valoró el efecto de la edad del donante y fotoperiodo, así como de la aplicación de implantes de melatonina en los sementales en primavera, la adición de antioxidantes (BHT vs melatonina) en el medio y el efecto del individuo en la criopreservación espermática. Para ello se utilizaron 8 moruecos (4 de cada raza), a los que se les colectó semen, desde 1 a 2.5 años de edad aproximadamente, realizando un total de 6 réplicas/experimento. Brevemente, tras recolectar los eyaculados y valorar su motilidad masal y volumen, éstos fueron mezclados y divididos en las alícuotas requeridas en cada experimento, excepto cuando se congeló individualmente. Para la eliminación del plasma seminal, el semen se centrifugó 2 veces (a 600 g por 10') y el sedimento fue resuspendido en el diluyente correspondiente a una concentración final de 400 x106 de espermatozoides/mL. Las distintas suspensiones fueron refrigeradas a 5ºC durante 4h, envasadas en pajuelas 0.25 mL y congeladas en vapores de nitrógeno y sumergidas en él hasta su descongelación (30'' a 37ºC). La viabilidad, morfología y resistencia osmótica de las suspensiones espermáticas en fresco y refrigeradas se evaluó mediante eosina-nigrosina y el test de endosmosis (HOST). Los parámetros cinéticos tras la refrigeración y descongelación se analizaron mediante el sistema ISAS®, asi como la morfometría espermática siguiendo el protocolo comercial Diff-Quik. Para evaluar la integridad de las membranas espermáticas y actividad mitocondrial tras la descongelación, se utilizó una tinción cuádruple con las sondas fluorescentes (SYBR14, ioduro de propidio, lectina Arachis hipogea con Ficoeritrina y Mitotracker deep red,) y la ayuda de un citómetro de flujo. Los resultados obtenidos mostraron que la yema de huevo en polvo puede utilizarse de forma satisfactoria en la refrigeración y congelación de espermatozoides ovinos, presentando una mejor capacidad crioprotectora cuando se combina con glicerol y el sistema tampón TRIS. Por otra parte, la eliminación del plasma seminal mediante centrifugación mejoró la criosupervivencia espermática, aunque su presencia en los diluyentes no afectó negativamente la calidad seminal. Generalmente, la adición de BHT (5.0mM) mejoró la calidad de los espermatozoides conservados, independientemente del lavado del semen, edad del donante o fotoperiodo, mientras que el uso de melatonina como antioxidante en el diluyente, no. Tampoco el uso de implantes de melatonina proporcionó ninguna ventaja a la hora de conservar espermatozoides de morueco en primavera. Respecto a la edad del donante, nuestro trabajo parece indicar que el semen de moruecos de 18 meses, junto la adición de BHT en el diluyente, presenta una criosupervivencia similar a la de individuos mayores. Por último, la congelación individualizada del semen de nuestros moruecos parece mostrar la existencia de individuos malos, buenos y también "regulares" congeladores.In order to optimize ram semen preservation of Xisqueta and Aranesa breeds, we studied alternatives to the fresh egg yolk in extender making to reduce heterogeneity, microbiology pollution and some components that interfere negatively in its cryoprotection capability, analyzing different types of egg yolk (fresh, powdered and clarified). Simultaneously, seminal plasma removal previous to cryopreservation and donor age were tested. Secondly, our aim was to obtain an extender free of animal origin cryoprotectants with a clearly-defined composition, therefore the efficiency of the soy lecithin or butylhydroxytoluene (BHT), combined with glycerol or trehalose were assessed. Moreover, the effect of two buffer systems, TRIS vs TEST, and the addition of BHT as antioxidant on sperm cryosurvival was analyzed. Optimal concentration of BHT and the presence of seminal plasma in the extender were also studied. Finally, donor age and photoperiod as the application of melatonin implants on rams in spring, the addition of antioxidants (BHT vs melatonin) in the extender and individual effect on sperm cryopreservation were evaluated. Therefore, semen from 8 rams (4 of each breed from 1 to 2.5 years old approximately) were collected, doing a total of 6 replicas/experiment. Briefly, after semen collection, mass motility and volume were assessed. Then ejaculates were pooled and split in the required aliquots in each experiment, except when semen was preserved individually. For seminal plasma removal, pooled semen was centrifuged twice (at 600 g for 10 minutes) and the sediment was resuspended in the corresponding media at a final concentration of 400 x106 of sperm/mL. The different sperm samples were refrigerated at 5ºC during 4h, packaged in straws of 0.25 mL, freezed in nitrogen vapors and immerged in it, until the samples were thawed (30'' at 37ºC). Viability, morphology and osmotic resistance of fresh and refrigerated sperm samples were tested by eosine-nigrosine stain and hypoosmotic swelling test (HOST). The kinetic parameters after the refrigeration and thawing were analyzed by ISAS® system as sperm morphometry, following the trade protocol Diff-Quik. Integrity of sperm membranes and mitochondrial activity after the thawing were evaluate using a quadruple fluorescent stain (SYBR14, propidium iodide, Arachis hipogea lecithin labeled with phycoerithin and Mitotracker deep red) with a flow cytometer. Our results showed that powdered egg yolk can be used satisfactorily on refrigeration and cryopreservation of ram semen, obtaining a better cryoprotectant capability when is combined with glycerol and TRIS buffer system. On the other hand, seminal plasma removal by centrifugation improved sperm cryosurvival, although its presence in the extender does not affect negatively sperm quality. Generally, the supplementation of BHT (5.0mM) improved the quality of preserved sperms, regardless of semen washing, donor age or photoperiod, meanwhile the use of melatonin as antioxidant in the media does not. Neither the use of melatonin implants on males provided any advantage on ram sperm cryopreservation in spring. Related to the age of the donor, our work seems to indicate that semen from 18 months old rams, together to the addition of the BHT in the extender, shows a similar cryosurvival that semen of older males. Finally, the individual semen preservation seems to show the existence of bad, good and regular freezer rams