Anàlisi de paràmetres que influeixen en la derivació de línies de cèl·lules mare embrionàries de ratolí a partir de blastòmers aïllats

La derivació de línies de cèl∙lules mare embrionàries (ESCs) depèn de factors relacionats tant amb l'embrió com amb el procés de derivació, el coneixement dels quals és de gran importància per tal d'incrementar l'eficiència d'establiment d'aquestes línies. Les ESCs de ratolí (mESCs), en concret, representen un model d'especial rellevància en ciència bàsica per tal d'optimitzar uns protocols de derivació. La present tesi doctoral pretén aclarir alguns dels paràmetres que podrien ser importants durant el procés de derivació de mESCs a partir de blastòmers aïllats dels estadis embrionaris de 4 i 8 cèl∙lules. En la primera part del treball, s'ha analitzat la influència del mètode de derivació, el nombre de blastòmers aïllats i l'estadi embrionari, en l'eficiència d'establiment de línies de mESCs. Els resultats obtinguts indicaren que l'eficiència d'establiment és més elevada quan es produeix en un medi de cultiu definit sense sèrum evitant, així, la diferenciació espontània. Pel que respecta a la influència del nombre de blastòmers aïllats, tant en estadi de 4 com 8 cèl∙lules, el rendiment del procés incrementa utilitzant un major nombre de blastòmers aïllats, de manera que la màxima eficiència es produeix quan s'utilitza la meitat de l'embrió com a màxim per no comprometre la viabilitat del mateix. Finalment, els estadis embrionaris que van aportar una major eficiència de derivació de línies van ser els estadis posteriors a la compactació (mòrula i blastocist). No es van trobar diferències entre els estadis de 4 i 8 cèl∙lules. Recentment, s'ha determinat la importància de les unions adherents amb E-cadherina en la derivació i el manteniment de línies de mESCs i també humanes (hESCs). En una segona part del treball es va estudiar la importància d'aquest tipus d'unió tant en la proliferació com en l'inici del procés de derivació a partir de blastòmers únics aïllats en estadi de 8 cèl∙lules (grup 1/8). Amb aquest objectiu es va unir una proteïna quimèrica formada pel domini extracel∙lular de l'E-cadherina i el domini Fc de la IgG1 humana (E-cad-Fc) a la superfície dels blastòmers del grup de 1/8. Aquesta proteïna quimèrica es creu que desencadena una cascada de senyalització semblant a la que es produiria quan dos o més blastòmers contacten a través d'unions amb E-cadherina nativa, el que es tradueix en un increment en la taxa de divisió dels blastòmers individuals i en l'eficiència de derivació de mESCs després d'una exposició de 24 h. Finalment, donat que existeixen evidències moleculars i citològiques que indiquen que els blastòmers podrien tenir la seva localització en la ICM o el trofectoderma (TE) del blastocist prefixada ja en estadis embrionaris primerencs, l'aïllament d'un blastòmer concret de l'embrió amb un destí preferencial a formar part de la ICM podria incrementar l'eficiència del procés de derivació. En la part final del treball, es va intentar determinar si l'aïllament de blastòmers concrets en estadi de 4 cèl∙lules produeix eficiències de derivació diferents en funció de l'ordre i l'orientació dels plans de divisió en estadi de 2 cèl∙lules. A partir d'experiments de seguiment dels blastòmers al llarg del desenvolupament amb un colorant lipofílic vam determinar que els blastòmers procedents de la primera divisió en sentit equatorial tendien a formar part del TE del blastocist. No es va trobar una tendència clara per als blastòmers procedents de la primera divisió en estadi de 2 cèl∙lules en sentit meridional. Els experiments de derivació de línies de mESCs, en canvi, mostraren eficiències de derivació semblants per tots els grups estudiats. Se sap que l'aïllament de blastòmers pot incrementar el seu potencial de desenvolupament, de manera que tots ells tindrien les mateixes possibilitats de formar una línia de mESCs.The derivation of embryonic stem cell lines (ESCs) depends on factors related to both the embryo and the derivation process, which knowledge is of great importance to increase the establishment efficiency of these lines. Mouse ESCs (mESCs), in particular, represent a model of special relevance in basic science to optimize the derivation protocols. This thesis aims to clarify some of the parameters that could be important during mESCs derivation from isolated blastomeres at 4- and 8-cell stages. In the first part of this work, we tested the influence of the derivation method, the number of isolated blastomeres and the embryonic stage on the derivation efficiency of mESCs. Results indicated that the establishment efficiency is higher when a defined medium is used without adding fetal calf serum, thus avoiding spontaneous differentiation. Regarding the influence of the number of isolated blastomeres, both at 4- and 8-cell stages, the efficiency of the process increases using a higher number of isolated blastomeres, so that maximum efficiency is observed when using the half the embryo as a maximum to not compromise the viability of it. Finally, the embryonic stages that offer greater efficiency of mESCs lines were post-compacted stages (morula and blastocyst). No differences were found between 4- and 8-cell stages. Recently, it has been determined the importance of E-cadherin adherents junctions in the derivation and maintenance of mESCs lines and also in human (hESC). In the second part of this work, we studied the importance of this type of junction in both proliferation and in the beginning of the derivation process from single and isolated blastomeres at the 8-cell stage (group 1/8). To this end, we adhered a chimeric protein consisting of the extracellular domain of E-cadherin and the Fc domain of human IgG1 (E-cad-Fc) on the surface of 1/8 blastomeres. This chimeric protein is thought to simulate the signaling produced when two or more blastomeres contact through native E-cadherin junctions. This resulted in an increased division rate of individual blastomeres and in the derivation efficiency of mESCs after an exposure of 24 h. Finally, given that there are molecular and cytological evidence suggesting that early blastomeres may have a predefined fate in their future allocation in the ICM or trophectoderm (TE) of the blastocyst, the isolation of a particular blastomere which has a predetermination to be allocated in the ICM could increase the derivation efficiency. At the end of the work, we tried to determine if the isolation of individual blastomeres at the 4-cell stage cells produced an increased derivation efficiency based on the order and orientation of the division plans at the 2-cell stage. From lineage tracing experiments with a lipophilic dye, we observed that blastomeres from the first division in an equatorial orientation tend to contribute to the TE with more cells. We did not find a clear tendency from blastomeres originated from a meridional division. Experiments about mESC derivation showed similar efficiencies from all the groups studied. It is known that the isolation of blastomeres may increase their developmental potential, so they all would have the same chance to derive an ESC line