Efecte del diàmetre fol·licular sobre el desenvolupament i la qualitat dels embrions caprins produïts in vitro

El principal objectiu d'aquesta tesis ha estat determinar si el diàmetre fol·licular és un bon paràmetre no invasiu per tal d'avaluar la qualitat de l'oòcit en funció de la seva competència per al desenvolupament embrionari i la qualitat del blastòcit resultant en la cabra prepúber. A més, s'ha proposat una nova estratègia per tal d'incrementar el desenvolupament embrionari d'aquells oòcits compromesos degut al petit diàmetre ( 3 mm) del seu fol·licle d'origen. Per portar-ho a terme es van realitzar tres estudis. L'objectiu del primer estudi va ser avaluar alguns paràmetres ovocitaris (diàmetre ovocitari, apoptosi inicial i tardana), el desenvolupament embrionari i la qualitat del blastòcit (número mig de cèl·lules, ploïdia cromosòmica) dels oòcits de cabra prepúber de fol·licles petits ( 3 mm), grans (≥3 mm) i d'un grup control (no seleccionats pel seu diàmetre fol·licular). Els oòcits de fol·licles ≥3 mm de diàmetre es van obtenir per la tècnica d'aspiració amb una agulla 21G i una xeringa d'insulina, els oòcits de fol·licles 3 mm van ser recuperats per la tècnica de slicing d'ovaris que prèviament havien estat aspirats i els oòcits control van ser recuperats per slicing però d'ovaris que prèviament no havien estat aspirats. Abans de la maduració in vitro, un grup d'oòcits eren mesurats i processats per a la tinció d'Annexin-V o l'assaig de TUNEL, mentre que la resta dels oòcits eren madurats, fecundats i cultivats in vitro durant 8 dies. Els blastòcits obtinguts van ser fixats i processats per a la Hibridació In Situ Fluorescent (FISH) amb sondes ovines de pintat específiques per els cromosomes X i Y. Els oòcits de fol·licles ≥3 mm van presentar un major diàmetre ovocitari mig (128.27 ± 7.20 μm vs. 125.35 ± 7.59 μm; P 0.05), major percentatge d'oòcits TUNEL positiu (42.86% vs. 24.23%; P 0.05), major percentatge de dividits (47.85 ± 3.98% vs. 23.07 ± 2.44 %; P 0.05) i de blastòcits (19.77 ± 3.04% vs. 4.11 ± 1.10 %; P 0.05) que els oòcits de fol·licles 3 mm. No obstant, els blastòcits de fol·licles ≥3 mm i 3 mm no van presentar diferències en el número mig de cèl·lules (123.83 ± 49.62 vs. 104.29 ± 36.09, respectivament). A més, no es van trobar diferències significatives en el percentatge de blastòcits amb ploïdia anormal en els embrions produïts a partir d'oòcits de diferent diàmetre fol·licular. Tot i així, els blastòcits de fol·licles grans tenien un percentatge significativament menor de nuclis diploides i un major percentatge de nuclis tetraploides en comparació als blastòcits produïts a partir de fol·licles petits. En conclusió, es va observar una relació positiva entre el diàmetre fol·licular, el diàmetre ovocitari i el desenvolupament embrionari en cabres prepúbers. Per tant, el diàmetre fol·licular és un bon criteri de selecció pels oòcits de femelles prepúbers. És important destacar que tot i que els oòcits de fol·licles grans presentaven major percentatge d'apoptosi tardana (TUNEL positius) que els oòcits de fol·licles petits això no es va correlacionar amb un menor desenvolupament embrionari. Pràcticament tots els blastòcits produïts in vitro van ser mixoploides sense haver-hi diferències entre els diferents grups fol·liculars. L'elevat percentatge de blastòmers tetraploides observats en els oòcits que procedien de fol·licles grans podria conduir a un major desenvolupament d'aquests blastòcits. El segon estudi va sorgir com a conseqüència dels resultats obtinguts en el primer treball. La selecció dels oòcits de fol·licles grans ens va permetre obtenir un percentatge de blastòcits similar als descrits en cabres adultes (23-26%) (Crozet i col., 1995; Leoni i col., 2009). Per tant, això podria indicar que el factor determinant en la competència ovocitària és el diàmetre fol·licular i no l'edat de la femella. El principal objectiu en aquest estudi va ser determinar en els oòcits de cabra prepúber i adulta, l'efecte de la grandària fol·licular ( 3 mm i ≥ 3 mm) en la producció i la qualitat dels blastòcits. Els oòcits de cabres no estimulades hormonalment van ser recuperats in vivo per la tècnica de LOPU mentre que els de cabres prepúbers es van obtenir d'ovaris d'escorxador i de la mateixa manera que s'ha descrit en el primer estudi. Els oòcits van ser madurats i fecundats in vitro, i els embrions resultants van ser cultivats durant 8 dies addicionals. Tots els blastòcits amb una bona morfologia van ser vitrificats i després de la descongelació la seva re-expansió va ser avaluada. Finalment, aquells blastòcits que van sobreviure al procés de vitrificació/descongelació es va analitzar la seva ploïdia mitjançant la FISH amb una sonda ovina de pintat específic pels cromosomes X, Y i 20. El percentatge dels blastòcits obtinguts a partir del grup fol·licular de grandària 3 mm va ser major en cabres adultes que en prepúbers (28.17% vs. 5.45%, respectivament; P 0.05). Pràcticament tots els blastòcits analitzats presentaven mixoploïdia (96.43%) no obstant, el percentatge de blastòmers diploides era significativament majors en blastòcits que provenien de fol·licles ≥3 mm en cabres adultes i prepúbers (84.73% and 80.82%) que en aquells blastòcits de fol·licles petits (62.18% and 73.63%). A més l'edat de la donadora no va afectar significativament la ploïdia embrionària i la re-expansió del blastòcit després de la descongelació quan la criosuperviviència era analitzada. Així doncs, l'edat de la donadora influencia el percentatge de blastòcits si els oòcits provenen de fol·licles 3 mm però no si aquests són recuperats de fol·licles majors a 3 mm. En relació a la qualitat dels blastòcits, el diàmetre fol·licular té efecte sobre la ploïdia dels nuclis dels blastòcits però no l'edat de la donadora. L'ovari de femelles prepúbers es troba quasi exclusivament constituït per fol·licles amb un diàmetre inferior a 3 mm (Martino i col., 1994). A més, en els dos estudis anteriors hem observat que els oòcits de fol·licles petits mostren una baixa competència per al desenvolupament. Així doncs, en aquest tercer estudi vam intentar dissenyar una nova estratègia per millorar el desenvolupament embrionari d'aquells oòcits compromesos pel diàmetre del seu fol·licle. En boví, s'ha observat que l'addició de "Oocyte Secreted Factors" (OSFs), BMP15 o GDF9 al medi MIV millorava el desenvolupament embrionari i la qualitat de l'embrió valorada per un increment del número de cèl·lules en el blastòcit i la supervivència fetal (Hussein i col., 2006). L'objectiu d'aquest estudi va ser investigar, en cabres prepúbers, l'efecte dels OSFs secretats pels oòcits denudats (ODs) de fol·licles petits ( 3 mm) o grans (≥3 mm) durant la MIV sobre el desenvolupament embrionari i la qualitat del blastòcits dels complexes cumulus-oòcit (COCs) de fol·licles petits i determinar si el GDF9 participa en aquest procés. Els grups tractament eren: (A) els COCs no seleccionats pel seu diàmetre fol·licular (grup control); (B) els complexes cumulus-oòcit de fol·licles petits (SFCOCs), (C) els complexes cumulus-oòcit de fol·licles petits co-cultivat amb oòcits denudats de fol·licles petits (SFCOCs + SFDOs), i (D) els complexes cumulus-oòcit de fol·licles petits co¬cultivats amb oòcits denudats de fol·licles grans (SFCOCs + LFDOs). L'efecte d'addicionar l'inhibidor kinasa SB-431542, que antagonitza el GDF9, va ser testat en els tractament A, C i D. El co-cultiu de SFCOCs amb SFDOs o LFDOs va incrementar significativament el percentatge de blastòcits en comparació al grup no co-cultivat SFCOCs (15.77%, 17.39% vs. 10.31%, respectivament). Els blastòcits del grup SFCOCs + LFDOs van mostrar un major percentatge de nuclis tetraploides que els blastòcits del grup SFCOCs i el grup control (14.43% vs. 5.45% and 5.24%, respectivament; P 0.05) No obstant, no vam observar diferències en el percentatge d'eclosionats, el número mig de cèl·lules per blastòcit o la criotolerància embrionària (P>0.05) entre els quatre grups tractament. L'addició de SB-431542 durant la MIV no va tenir cap efecte en el percentatge de blastòcits (P>0.05). En conclusió, en cabres prepúbers, el baix desenvolupament embrionari dels complexes cumulus-òocit de fol·licles petits ( 3 mm) pot ser millorat mitjançant el seu co-cultiu amb els oòcits denudats tan de fol·licles petits com grans i el GDF9 no sembla tenir cap paper en aquesta millora. Així doncs, l'addició d'alguns factors secretats pels oòcits al medi de maduració in vitro podria proporcionar-nos una nova eina per tal d'optimitzar els nostres protocols de producció in vitro d'embrions.The main objective in this thesis has been to determine if the follicle diameter is a good non-invasive parameter to assess the oocyte quality according to its development competence and the quality of resultant blastocyst in prepubertal goat. Furthermore, we have tried to find a new strategy to increase the embryo development of those oocytes compromise due to the small diameter ( 3 mm) of their follicle source. To carry out that we performed three studies. The aim of the first study was to asses some oocyte parameters (oocyte diameter, early and late apoptosis), embryo development and blastocyst quality (mean cell number, chromosomal ploidy) in prepubertal goat oocytes from small ( 3 mm), large (≥3 mm) follicles and control group (not selected by their follicle diameter). Oocytes from follicles ≥3 mm of diameter were obtained by aspiration technique with a 21 G needle and insulin syringe, oocytes from follicles 3 mm were recovered by slicing technique from ovaries previously aspirated and control oocytes were recovered by slicing but from ovaries not previously aspirated. Before in vitro maturation, some oocytes were measured and processed for Annexin-V stain or TUNEL assay whereas the rest of the oocytes were matured, fertilized and cultured in vitro for 8 days. The resultant blastocysts were fixed and processed for Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with ovine painting probes specific for chromosomes X and Y. Oocyte from follicles ≥3 mm showed greater mean oocyte diameter (128.27 ± 7.20 μm vs. 125.35 ± 7.59 μm; P 0.05), higher percentages of oocytes TUNEL positive (42.86% vs. 24.23%; P 0.05), higher cleavage (47.85 ± 3.98% vs. 23.07 ± 2.44 %; P 0.05) and blastocyst rates (19.77 ± 3.04% vs. 4.11 ± 1.10 %; P 0.05) than oocytes from follicles 0.05) for follicles from ≥3 mm and 3 mm, respectively. Not significant differences in the percentage of blastocysts with abnormal ploidy were found in embryos produced from oocytes of different follicle diameter. However, blastocysts from large follicles had a significantly lower rate of diploid nuclei and higher rate of tetraploid nuclei in comparison to blastocysts from small follicles. In conclusion, we have observed a positive relationship between follicular diameter, oocyte diameter and embryo development in prepubertal goats. Then follicle diameter is a good selection criterion for oocytes in prepubertal females. It is noteworthy to highlight although oocytes from the largest follicles presented higher percentage of TUNEL-positive apoptosis than oocytes from small follicles it did not correlate with a negative embryo development. Practically all in vitro produced blastocysts were mixoploids without differences between follicular diameter groups. The high number of tetraploid blastomeres found in embryos coming from oocytes of largest follicles could be due to the further development of these blastocysts. The second study was arisen due to the results obtained in the first work. The selection of oocytes from large follicles allowed us to obtain similar blastocyst rate than those described in adult goats (23-26%) (Crozet et al., 1995; Leoni et al., 2009). Then, this could indicate that the main factor for the oocyte competence is the follicle diameter and not the age of the female. The aim in this study was to determine in oocytes of prepubertal and adult goats, the effect of follicle size ( 3 mm and ≥3 mm) on the production and the quality of blastocysts. Oocytes from hormonally unstimulated adult goats were recovered in vivo by LOPU technique whereas those from prepubertal goats were obtained from slaughterhouse ovaries as previously described in the first study. Oocytes were matured and fertilized in vitro, and resulting embryos were cultured for additional 8 days. All blastocysts with a good morphology were vitrified and blastocyst re-expansion after warming was assessed. Finally, those blastocysts which survived to vitrification/warming process their ploidy was analysed by FISH using ovine painting probes specific for chromosomes X, Y and 20. The percentage of blastocysts obtained from 3 mm follicular size group was higher in adult than in prepubertal goats (28.17% vs. 5.45%, respectively; P 0.05). Almost all the blastocsysts analysed presented mixoploidy (96.43%) however, the percentage of diploid blastomeres was significantly higher in blastocysts coming from follicles ≥3 mm in adult and prepubertal goats (84.73% and 80.82%) than those from small follicles (62.18% and 73.63%). Moreover, goat age did not significantly affect embryo ploidy and blastocyst re-expansion after warming when cryosurvival was analyzed. Therefore, the donor's age influence on blastocyst rate if the oocytes come from follicles 3 mm but not if they are recovered from follicles greater than 3mm. In relation to blastocyst quality, the follicle diameter influences the ploidy of blastocyst nuclei but not the donor age. The ovary from prepubertal goats is nearly exclusively constituted by follicles with a diameter lower than 3 mm (Martino et al., 1994b). Furthermore, in the two previous studies we have observed that oocytes from small follicles show a low development competence. Therefore, in this third study we tried to design a new strategy to improve the embryo development of those oocytes compromised by their follicle diameter. In bovine, it has been observed that the addition of Oocyte Secreted Factors (OSFs), BMP15 or GDF9, in the IVM medium improved the embryo development and embryo quality assessed by an increase in the blastocyst cell number and foetal survival (Hussein et al., 2006). The aim of this study was to investigate, in prepubertal goats, the effect of OSFs secreted by denuded oocytes (DOs) from small ( 3 mm) or large (≥3 mm) follicles during IVM on embryo development and the blastocyst quality of cumulus-oocyte complexes (COCs) from small follicles and to determine if GDF9 participates in this process. Treatment groups were: (A) COCs non selected by their follicle size (control group); (B) cumulus oocytes complexes from small follicles (SFCOCs), (C) cumulus oocytes complexes from small follicles co-cultured with denuded oocytes from small follicles (SFCOCs + SFDOs), and (D) cumulus oocytes complexes from small follicles co-cultured with denuded oocytes from large follicles (SFCOCs + LFDOs). The effect of the addition of kinase inhibitor SB-431542, which antagonizes GDF9, was tested in A, C and D treatment groups. The co-culture of SFCOCs with SFDOs or LFDOs significantly augmented the blastocyst rate in comparison to SFCOCs alone (15.77 %, 17.39 % vs. 10.31 %, respectively). Blastocysts from SFCOCs + LFDOs group showed higher rates of tetraploid nuclei than blastocysts from SFCOCs and the control group (14.43 % vs. 5.45 % and 5.24 %, respectively; P 0.05). However, we did not observe differences in the hatching rate, mean cell number or embryo cryotolerance (P > 0.05) between the four treatment groups. The addition of SB-431542 during IVM did not have any effect on blastocyst rate (P>0.05). In conclusion, in prepubertal goats, the cumulus-oocyte complexes with a low embryo developmental competence due to their follicle origin (from small follicles) can be improved by co-culturing them with denuded oocytes from both small and large follicles and GDF9 does not seem to play a part in this improvement. Therefore, the addition of some oocyte secreted factors to the in vitro maturation medium could provide us with a new tool to optimize our in vitro embryo production protocols