Estudio de la alergenicidad en Alt a 1, una proteína única de hongos

La alergia es un problema social que supone una grave disminución de la calidad de vida del paciente, estando considerada como la mayor enfermedad crónica en Europa en la actualidad. Desde mediados del siglo XX, se ha producido un incremento en la prevalencia de estas enfermedades. Sin embargo, el origen de este incremento y el factor que desencadena las alergias son desconocidos. El conocimiento de este factor sería de gran ayuda para poder prevenir y tratar este tipo de enfermedades. El objetivo principal de esta Tesis ha sido estudiar los mecanismos moleculares que están implicados en los procesos de sensibilización alérgica. Para ello, la investigación se ha centrado en Alt a 1, alérgeno principal del hongo Alternaria alternata que ha sido caracterizado desde los puntos de vista estructural, fisiológico e inmunológico. La proteína Alt a 1 está relacionada con asma crónica y patogénesis en plantas, aunque su función biológica es desconocida. Sin embargo, en esta Tesis se ha podido caracterizar a este alérgeno como efector, siendo secretado por la espora del hongo en el momento en que se encuentra en la superficie de la planta, e inhibiendo a proteínas de defensa como PR5. Por otro lado, a partir de la estructura tridimensional de Alt a 1 determinada mediante cristalografía de rayos X, en esta Tesis se ha estudiado in silico el comportamiento, estabilidad y propiedades de varios estados de agregación de este singular alérgeno. Ese estudio, realizado en solución acuosa salina mediante cálculos de Dinámica Molecular, ha logrado dilucidar la evolución dinámica de la estabilidad, propiedades e interacciones de los diferentes estados de oligomerización de Alt a 1 que resultan depender de la presencia de ligandos y de cambios en el pH del medio. Combinando ensayos experimentales in vitro con procedimientos computacionales de análisis in silico (cálculos de docking y modelado molecular), en esta Tesis también se ha identificado la presencia de un ligando unido a Alt a 1, relacionado con la familia de los flavonoides. Aunque no ha sido posible identificar con total precisión el compuesto químico de que se trata, las evidencias experimentales que aquí se presentan, han permitido proponer una estructura plausible con un soporte flavona. Finalmente, se ha abordado la respuesta inmunológica producida por Alt a 1 en el epitelio bronquial. De forma análoga a lo que sucede cuando Alternaria entra en contacto con una planta, se ha observado que la presencia de esporas produce un incremento en la secreción de proteínas de defensa con las que Alt a 1 es capaz de interaccionar. Los hechos que desencadenan este reconocimiento cursan con la liberación del ligando y favorecen la formación de la estructura dimérica de Alt a 1. Esta forma dimérica es la que eventualmente puede ser reconocida por las células presentadoras de antígeno desencadenando la respuesta alérgica. Resumiendo, los datos expuestos en esta Tesis revelan que el conocimiento de la actividad biológica de un alérgeno aporta una información absolutamente esencial para comprender su intervención en los mecanismos que provocan el desencadenamiento de una reacción alérgica. ABSTRACT Allergy is a social problem that represents a serious decrease in quality of life of the patients, being considered the biggest chronic disease in Europe today. Since mid-twentieth century, a large increase in the prevalence of these diseases has occurred. However, the underlying causes for this increase and the factors that trigger allergy are still unknown. The knowledge of these factors would be very valuable to prevent and treat allergy disease. The main aim of this doctoral thesis was to study the molecular mechanisms involved in the allergic sensitization processes. With this purpose, the research was focused on Alt a 1, the major allergen from the fungus Alternaria alternata, which has been characterized from structural, physiological, and immunological standpoints. Alt a 1 protein is related to chronic asthma and pathogenesis in plants, although its biological function still remains unknown. However, this allergen has been characterized in this doctoral thesis as an effector which is released when the fungal spores reach the plant surface and is able to inhibit plant defense proteins such as PR5. On the other side, based upon the three-dimensional structure of Alt a 1 obtained in X-ray crystallography, this doctoral thesis also presents an in silico study of the behavior, stability, and properties of several aggregation states of this singular allergen. This study, conducted on salt aqueous solution by means of Molecular Dynamics simulations, has managed to elucidate the dynamical evolution of stabilities, properties, and interactions of the different oligomerization states of Alt a 1 that happened to depend on the presence of ligands and on the pH of the medium. By combining experimental assays in vitro and computational procedures for analyses in silico, the presence of a flavonoid-type ligand bound to Alt a 1 has been also identified in this doctoral thesis. Although it has not been possible to elucidate the precise chemical nature of this ligand, the experimental evidence reported has allowed to propose a plausible structure based on a flavone-like moiety. Finally, the immune response triggered by Alt a 1 in bronchial epithelium was studied. In a similar manner to what happens when Alternaria contacts plants, it has been observed that the presence of fungal spores produces an increase in secretion of defense proteins. Moreover, is has been also observed that Alt a 1 is able to interact with those proteins. The sequence of events that lead to this molecular recognition occur with release of the ligand and promote dimerization of Alt a 1. This dimeric structure is that which is ultimately recognized by antigen presenting cells, thus triggering the allergic response. Summarizing, data presented in this doctoral thesis demonstrate that the knowledge of the biological activity of an allergen provide essential information to better understand its participation in the complex mechanisms that lead to the allergic process