The role of microRNAs in haematopoiesis and immunity of Drosophila melanogaster

Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016A resposta imune de Drosophila melanogaster envolve múltiplas estratégias de defesa que são relativamente conservadas entre animais. De forma geral, esta resposta resulta da interacção entre uma componente humoral, também designada por imunidade sistémica, e uma componente celular, que implica a diferenciação de vários tipos de células especializadas. A imunidade sistémica consiste na produção de péptidos antimicrobianos (PAMs) pelas células do corpo adiposo e de componentes das reacções de melanização e de stress oxidativo que actuam no sentido de neutralizar patogéneos. Os PAMs acumulam-se na hemolinfa e a sua produção ocorre principalmente através das vias de sinalização Toll e Immune defficiency (Imd), que são activadas após o reconhecimento de certos componentes da parede celular de bactérias gram-positivas ou fungos e bactérias gram-negativas, respectivamente. Além disso, existem outras vias de sinalização que tembém podem participar na resposta humoral. A via JNK (JUN N-terminal kinase) é activada por componentes da via Imd e tem um papel importante na indução de apoptose e na remodelação do citoesqueleto e adesão das células. Além disso, está envolvida na resistência ao stress oxidativo. A via JAK-STAT, por sua vez, está relacionada com a resposta à infecção viral e com a produção de citocinas e factores de resposta ao stress. Embora a existência de diferentes cascatas de sinalização confira especificidade à resposta imune, certos tipos de infecção podem levar a uma activação sinergística das mesmas vias. As lesões sépticas (picada com uma agulha embebida em solução bacteriana), por exemplo, activam tanto a via Toll como a via Imd, levando à produção de PAMs como a Diptericina e a Drosomicina. A componente celular da resposta imune de D. melanogaster tem como intervenientes principais os hemócitos (células do sangue), que são descritos como funcionalmente análogos à linhagem mielóide dos vertebrados. Em homeostase, 90% dos hemócitos são plasmatócitos, que têm capacidade fagocítica e contribuem para a activação da produção de PAMs, e 10% são células cristal, que participam nas reacções de melanização e na regeneração de feridas. Além disso, mediante a ocorrência de uma ferida ou de endoparasitismo, há diferenciação de lamelócitos sob o controlo da via JAK-STAT, que são importantes para a encapsulação de microorganismos de maiores dimensões. Os efectores da componente celular da resposta imune são gerados e mantidos através do processo de desenvolvimento designado de hematopoiese, que ocorre ao longo do ciclo de vida em diferentes compartimentos. Nos estadios larvares, onde este processo é mais activo, a glândula linfática é o principal orgão hematopoiético em que células progenitoras dão origem a plasmatócitos e células cristal. Fora deste órgão, existem hemócitos em circulação e em agregados sésseis na epiderme dorsal ao longo dos segmentos corporais. Nestes tecidos existe também proliferação e diferenciação de hemócitos, que se encontram em equilíbrio dinâmico com o compartimento circulatório. Embora a exacta contribuição de cada uma das componentes da resposta imune ainda não esteja bem estabelecida, a sua acção combinada pensa-se que seja importante para a neutralização e eliminação de microorganismos invasores. Os microRNAs (miRNAs), classificados como sequências curtas e não codificantes que actuam através do silenciamento da expressão génica, têm vindo a emergir como reguladores de muitos programas de desenvolvimento animal e de muitas respostas biológicas, incluindo a resposta imune. Enquanto nos vertebrados o repertório de funções descritas para os miRNAs inclui tanto a regulação da diferenciação e proliferação celular durante a hematopoiese, como a produção de anticorpos e citocinas, nos invertebrados, e particularmente em D. melanogaster, a informação relativa à função dos miRNAs torna-se relativamente escassa. Este projecto pretende abordar esta questão e dissecar o papel destas sequências no sistema imune de D. melanogaster, através de screens sistemáticos que englobam a maioria dos microRNAs presentes no genoma deste organismo modelo. Incidindo tanto no processo de hematopoiese larvar, que dá origem aos efectores da componente celular, como na resposta imune sistémica dos adultos, cuja função influencia a resistência à infecção bacteriana, os nossos resultados indicam que vários miRNAs têm papéis regulatórios importantes nestas duas vertentes da resposta imune. Os resultados obtidos através de infecção sistémica com Pseudomonas entomophila e Pseudomonas putida, duas bactérias do tipo gram-negativo, mostram que as delecções dos mir-317 e mir-137 aumentam a susceptibilidade à infecção bacteriana, causando taxas de mortalidade elevadas. Por outro lado, a delecção do cluster mir-100/let-7/mir-125 revela uma redução da mortalidade no contexto de infecção, provavelmente relacionada com uma maior resistência ou tolerância à infecção com bactérias gram-negativas. Apesar de apresentarem dinâmicas opostas entre as duas bactérias testadas, também as delecções do mir-31b e do mir-2b-1 apresentam diferenças significativas na susceptibilidade à infecção bacteriana. De acordo com as previsões bioinformáticas, os alvos destas sequências incluem vários componentes da resposta imune sistémica, nomeadamente proteínas das vias Imd e Toll, assim como componentes importantes para a regulação da resposta de stress oxidativo. Além disso, estes miRNAs têm como alvos proteínas importantes para a fisiologia geral do organismo, que também podem impactar a sobrevivência após infecção bacteriana. Por sua vez, os miRNAs também desempenham funções importantes na hematopoiese em D. melanogaster, particularmente no que toca à adesão e diferenciação de vários tipos de hemócitos. Os nossos resultados indicam que as delecções do mir-969 e do mir-124 causam aumento e diminuição da densidade de plasmatócitos nos agregados sésseis, respetivamente. Isto tem consequências para os números de células cristal, que dependem do correcto estabelecimento da densidade de plasmatócitos, já que estas se transdiferenciam a partir dos mesmos. Estas duas sequências de miRNAs têm como alvos genes importantes para a adesão e migração celular, processos estes que podem influenciar a densidade de plasmatócitos nos órgãos hematopoiéticos de D. melanogaster. A delecção do mir-1 em heterozigotia, por sua vez, revelou um decréscimo significativo na densidade de células cristal, indicando que este miRNA tem um papel importante na regulação da transdiferenciação deste tipo celular, processo este que é mediado pela sinalização Notch. A previsão bioinformática dos alvos desta sequência revela que o mir-1 inclui vários componentes da via de sinalização Notch, reforçando a ideia de que poderá regular o processo de diferenciação de células cristal. Finalmente, a delecção do mir-980 causa uma redução acentuada nos números de plasmatócitos e células cristal, levando a uma disrupção da estrutura e integridade dos tecidos hematopoiéticos larvares. Isto deve-se a uma diferenciação ectópica de lamelócitos, que entram em circulação e levam à formação de tumores melanóticos, como resultado da encapsulação exacerbada dos própios tecidos. A análise in silico dos alvos do mir-980 revelou que o mRNA de domeless, que codifica para o receptor da via JAK-STAT, interage fortemente com o mir-980. Uma vez disrompido o mecanismo de silenciamento deste gene, por via da delecção do mir-980, a sobreexpressão de Domeless poderá levar à activação da via JAKSTAT e consequentemente à diferenciação exacerbada de lamelócitos. Resultados preliminares revelam que a remoção do mir-980 causa uma mudança no padrão de activação da via JAK-STAT, possivelmente em tecidos como o corpo adiposo ou os músculos somáticos e uma pequena percentagem de hemócitos. No futuro, a análise detalhada da origem dos vários fenótipos observados permitirá a caracterização e compreensão do impacto deste mecanismo de regulação na resposta imune de D. melanogaster. Particularmente, será importante analisar o tempo e local de expressão dos miRNAs candidatos e os seus alvos, assim como a nessecidade e a suficiência de cada uma destas sequências para regulação dos vários mecanismos que contribuem para a resposta imune de D. melanogaster.The immune response of Drosophila melanogaster involves multiple innate defences that are conserved in higher organisms and have been largely characterized. Consisting of an interaction between a humoral and a cellular component, it is essential for the neutralization and elimination of invading microorganisms. While the humoral defences refer mainly to the production of antimicrobial peptides (AMPs), cellular defences include different haemocyte-mediated responses like phagocytosis, melanization and encapsulation. MicroRNAs, short non-coding sequences that silence gene expression, are emerging as regulators of several developmental programs and biological responses, including the immune response. Furthermore, they have been implicated in processes like antibody switching and lineage determination in mammalian haematopoiesis or regulation of AMP levels in D. melanogaster. Here we proposed to dissect the role of these sequences in the immune system of D. melanogaster by performing a systematic loss-of-function screen that covers the majority of microRNAs present in its genome. Focusing on both the larval haematopoiesis and the adult systemic response, we have revealed a set of candidate microRNAs that are important for the regulation of resistance to bacterial infection and haemocyte differentiation. Our results indicate mir-317 and mir- 137 loss-of-functions dramatically increase susceptibility to bacterial infection by Pseudomonas entomophila and Pseudomonas putida, leading to high mortality rates. On the other hand, the mir- 100/let-7/mir-125 cluster knock-out shows a significant decrease in mortality, related to higher resistance or tolerance to gram-negative bacterial infection. Furthermore, we have shown that mir-124 and mir-969 impact plasmatocyte adhesion, influencing the density of cells in the sessile haemocyte clusters of larvae. Deletion of mir-1 is important for the regulation of the differentiation of crystal cells, which are mainly involved in melanization and wound healing. Finally, we have shown that mir- 980 loss-of-function causes ectopic lamellocyte differentiation, a cryptic cell type that is crucial for the encapsulation mechanism and normally triggered upon parasitoid wasp infection. In silico predictions have revealed that these candidates can directly target immune-related genes and modulate their expression levels. Further investigation will allow us to provide a better understanding of the impact of these microRNAs on their corresponding targets and the immune response pathways that include them