Evaluation of Morinda citrifolia chemopreventive effects against patulin

Tese de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016Morinda citrifolia é uma planta endémica da Indonésia que pode ser encontrada em diversos países tropicais. Desde as folhas, às raízes passando pelo fruto, todas as partes desta planta têm vindo a ser usadas, há milhares de anos, para o tratamento de diversas doenças. Vulgarmente denominada “noni” entre os povos que a utilizam, esta planta possui propriedades antioxidantes, anticancerígenas, antifúngicas e antimicrobianas. O stress oxidativo, originado por factores endógenos ou exógenos, traduz-se pelo aumento de espécies reactivas de oxigénio (ROS). Este processo encontra-se intimamente ligado à lesão de estruturas celulares e macromoléculas, essenciais ao bom funcionamento da célula e do organismo. Entre muitos agentes exógenos a que o ser humano se encontra exposto, encontram-se as micotoxinas. A patulina (PAT) é uma micotoxina produzida por diversos géneros de fungos, sendo os mais comuns Penicillium e Aspergillus. Encontrada principalmente em maçãs em más condições e em produtos derivados destes frutos, esta micotoxina possui propriedades genotóxicas, cancerígenas, neurotóxicas e teratogénicas. A presença de micotoxinas nos alimentos deve-se principalmente a questões relacionadas com a colheita e armazenamento em más condições. O controlo dos alimentos sujeitos à contaminação é particularmente deficiente em regiões de terceiro mundo, locais onde a taxa de intoxicação por micotoxinas é maior. Os países mais pobres são também os que mais sofrem com as doenças associadas à exposição aguda e crónica a estas toxinas assim como são os que têm maior dificuldade em arranjar um tratamento adequado. O objectivo principal deste projecto foi estudar o efeito quimiopreventivo da fracção hexânica do fruto de noni face à citotoxicidade e genotoxicidade induzida pela patulina, com o intuito de descobrir uma possível alternativa para prevenir os efeitos nefastos desta micotoxina. Os objectivos específicos foram os seguintes: - Compreender o mecanismo de acção subjacente à potencial actividade anti-mutagénica da fracção em estudo através da utilização do sulfonato de etil metano (EMS) e do peróxido de hidrogénio (H2O2), como modelos de, respectivamente, um agente alquilante mutagénico e um oxidante. - Analisar o efeito quimiopreventivo do extracto comparativamente ao efeito de um agente reconhecidamente antioxidante, o ácido cafeico, face às lesões de ADN induzidas pelo peróxido de hidrogénio e patulina. A linha celular de hepatocarciona humano (HepG2) foi a escolhida para este estudo, uma vez que a PAT é metabolizada pelo fígado e é uma linha representativa do trato gastrointestinal. Os métodos utilizados foram o ensaio do MTT e do Cometa (modificado com FPG), para avaliar a citotoxicidade e genotoxicidade, respectivamente. Para determinar o efeito anti-citotóxico da fracção hexânica de noni, foram testados dois tipos de tratamentos: i) 24 horas de pré-exposição das células ao extracto (0.1 mg/mL) seguido de 24 horas de exposição à PAT (1,25 e 2,5 μM), ou EMS (10 e 20 mM) ou 2 horas de exposição ao H2O2 (0,4 e 0,5 mM), sem o extracto presente; ii) 24 horas de pré-exposição das células ao extracto (0,1 mg/mL) seguido de 24 horas de co-exposição à PAT, ao EMS ou 2 horas de co-exposição ao H2O2. Na mesma linha de pensamento foram executados dois tipos de tratamentos para a analisar o efeito anti-genotóxico, contudo com algumas diferenças na concentração e tempo de exposição ao tóxico. Para o EMS, foram testados os dois tratamentos, com a diferença que as células foram expostas ao tóxico apenas durante 1 hora e às concentrações de 5 e 10 mM. No caso da PAT apenas o tratamento com co-exposição foi testado, com a adição de mais concentrações (1,25, 5 e 10 μM) e sem alteração do tempo de exposição. Por último, a co-exposição das células ao H2O2 (0,05 e 0,1 mM) e ao extracto ocorreu apenas durante 5 minutos. Os dados foram analisados com recurso a análise variância (ANOVA) e ao teste t de Student, através do software SPSS, edição standard. Os resultados foram claros, sendo que todos os tóxicos testados demonstraram efeito citotóxico aos tempos de exposição definidos. Após os dois tipos de protocolos efectuados com o extrato de noni, verificou-se que apenas o que consistia na co-exposição entre o tóxico e o extracto de noni conferia protecção às células HepG2 face à toxicidade induzida. Assim, o efeito citotóxico despoletado por ambas as concentrações de EMS testadas (10 e 20 mM) foi significativamente atenuado pelo extracto de noni. No caso da PAT, apenas o efeito citotóxico da concentração mais elevada (2,5 μM) foi significativamente atenuado pelo extracto de noni. Por último, a toxicidade produzida por todas as concentrações de H2O2 sofreu um decréscimo pela presença do extrato de noni, embora com valores não significativos. Estes resultados indicam que o extracto de noni é mais eficaz face ao efeito citótoxico do EMS, seguido de PAT e H2O2. Relativamente à análise da genotoxicidade, apenas o EMS foi testado em dois tipos de tratamento diferentes. Neste caso, tal como na análise citotóxica, apenas o tratamento com co-exposição entre o extracto de noni e o tóxico conferiu alguma protecção às células HepG2, embora sem significância estatística. Os resultados da análise dos efeitos genotóxicos da PAT indicam que apenas o efeito da concentração mais alta (10 μM) foi atenuado pela co-exposição ao extracto de noni, não atingindo também valores significativos. Por outro lado, o co-tratamento com as restantes concentrações de PAT (1,25 e 5 μM) e o extrato de noni revelaram um efeito aditivo, isto é, um aumento de genotoxicidade, sendo significativo para a concentração 1,25 μM. Relativamente ao H2O2, o nível de lesões genotóxicas causado por ambas as concentrações testadas (0,05 e 0,1 mM) foram atenuados pela co-exposição ao extracto de noni, sendo significativo para a concentração mais baixa. Estes dados mostram que o extracto de noni é mais eficaz contra o efeito genotóxico do H2O2, seguido do EMS e PAT. Os resultados sugerem que o extracto de noni é capaz de atenuar os efeitos citotóxicos e genotóxicos despoletados pelos agentes tóxicos em estudo, sendo que esse efeito depende da concentração e dos efeitos produzidos por esses tóxicos. Com o intuito de avaliar a magnitude do efeito quimiopreventivo/antioxidante do extracto de noni os mesmos tratamentos foram aplicados com a substituição do extracto de noni por ácido cafeico, um reconhecido agente antioxidante. A análise da citotoxicidade sugeriu que o extracto de noni é mais eficaz do que o ácido cafeico (0,02 mM) na protecção das células face à toxicidade da PAT (1,25 e 2,5 μM) mas não contra o H2O2 (0,4 e 0,5 mM). Relativamente aos resultados da genotoxicidade, verificou-se a mesma tendência com o H2O2 (0,05 e 0,01 mM). Contudo, no caso da PAT, ambas as concentrações de ácido cafeico (0,01 e 0,02 mM) foram efetivas na atenuação dos efeitos de PAT (5 e 10 μM) enquanto que o extracto só foi capaz de atenuar o efeito da concentração mais elevada de PAT. Resumindo, os dados deste projecto confirmaram os efeitos benéficos, particularmente quimiopreventivos, previamente associados à planta Morinda citrifolia. Tanto o efeito antimutagénico (EMS) como o efeito antioxidante (PAT e H2O2) foram evidenciados nos resultados deste projecto. Quando comparado com um agente antioxidante, o extracto de noni demonstrou estar equiparado no que diz respeito à redução dos efeitos citotóxicos. Estes dados sugerem que o extracto de fruto de noni tem enormes potencialidades na prevenção de doenças, sugerindo uma alternativa económica para os povos menos desenvolvidos. Novos estudos devem ser desenvolvidos, com recurso a outros componentes da planta (folhas e raízes) assim como a frações extraídas com solventes com polaridade diferente (etanol e butanol) que poderão conter outros componentes e/ou concentrações diferentes desses compostos. O comportamento dos extratos utilizando uma linha celular hepática não cancerígena também seria de explorar com vista a uma melhor caracterização dos efeitos qumiopreventivos da noni.Morinda citrifolia (noni) is a tropical plant that has been studied for its content of phenolic compounds, which display antioxidant properties. Patulin (PAT) is one of the most common mycotoxins, frequently found in apples, representing a serious health because of its genotoxic effects that are mainly mediated by the formation of reactive oxygen species (ROS). Therefore, it is of utmost importance to identify bioactive natural compounds able to reduce the deleterious effects of patulin and other mycotoxins, in order to protect the human health. On the other hand, ethyl methanesulfonate (EMS) is a model alkylating agent inducing mostly point mutations and H2O2 is a model oxidant agent. This work intended to explore the chemopreventive properties of a noni fruit hexanic extract prepared in Brazil. Its potential capacity to reduce the cytotoxic and genotoxic effects of three compounds with dissimilar modes of action (MoA) – PAT, EMS and H2O2- was evaluated in a liver-derived human cell line (HepG2 cell line) through the MTT and the Comet assays, respectively. In order to comparatively analyze the antioxidant potency of the noni fruit hexanic extract, an antioxidant model (caffeic acid) was tested for the same parameters against PAT and H2O2. The results showed that cells pre-exposure to the extract followed by co-exposure to PAT, EMS and H2O2 was able to significantly reduce the level of cytotoxicity induced by the toxicants alone. A similar trend was verified for the genotoxicity studies. When compared to caffeic acid, the noni fruit hexanic extract was more efficient against patulin- and less against H2O2 –induced cytotoxicity, suggesting that patulin-induced damage is not only caused by oxidative stress. In conclusion, this study showed that the hexanic fraction of Morinda citrifolia fruit displays a chemopreventive action against several toxic agents. New studies must be made on the future, with different fractions, other parts of the plant (leaves and roots), and different cell lines