Impact of Plasmodium infection on the expression of bradykinin-receptor 2 on trophoblasts

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016Pregnant women living in malaria endemic areas are at high risk of developing severe infection that can lead to abortion, preterm delivery, intrauterine growth restrictions and foetal and maternal mortality. Plasmodium, the causing agent of malaria, infects erythrocytes that sequester in the placenta by interaction of Plasmodium specific proteins to receptors expressed on trophoblasts (placental cells). Placental response to infection is characterized by an exacerbated proinflammatory response, coagulopathy and fibrin accumulation, linking placental pathology to microcirculatory defects. This hostile environment impacts foetal development and viability. In vivo studies suggest that trophoblasts might respond to vasoactive factors leading to vasoconstriction or vasodilation. In fact, angiogenic and vasodilatory factors are expressed in trophoblasts; these molecules have a critical role in the maintenance of local homeostasis and normotension in uteroplacental perfusion. Unpublished results from our group showed that mRNA levels of bradykinin-receptor 2 (B2R) gene (Bdkrb2) among other vasoactive factors were downregulated at late gestation in mice infected with P. berghei compared to non-infected animals. Additionally, kininogen levels were also reduced in the peripheral blood and placentas of infected mice. We hypothesized that infection modulates B2R expression in trophoblasts leading to impaired signaling and to vasoconstriction of maternal blood spaces. Using an established placental malaria (PM) mouse model, we assessed percentage and surface expression of B2R on trophoblasts at late gestation (gestational day 18) and on primary trophoblasts co-cultured with Plasmodium-IEs (infected erythrocytes). The in vitro system was set as follows: trophoblasts were incubated with P. berghei-IEs or NIEs (non-infected erythrocytes) for 2 hours. In other conditions, trophoblasts were kept in culture for an additional period of 2 hours with medium only after incubation with IEs. The percentage of B2R+ trophoblasts was increased in a subpopulation of trophoblasts in G18 placentas from P. berghei-infected mice. B2R expression levels were reduced after 2 hours of incubation with IEs, an effect that seems to be maintained for an additional period of 2 hours. Furthermore, an increase in the percentage of cells expressing B2R was only observed after the additional 2-hour period of culture. Our results strongly suggest that Plasmodium infection is capable of modulating expression of B2R. This effect might impact the downstream signaling leading to insufficient vasodilation and possibly impaired placental perfusion, which can affect foetal growth and survival.A malária é uma doença que afecta um elevado número de indivíduos em todo o mundo. Todos os anos, milhares de pessoas são diagnosticadas como infectadas, das quais uma grande maioria sucumbe à doença. Durante os últimos anos, grandes esforços têm sido feitos para reduzir a prevalência e incidência da doença, no entanto, o número de casos é ainda alarmante. A grande maioria dos casos ocorre na África sub-Sahariana, onde a mortalidade é elevada, principalmente entre as crianças, podendo também estender-se aos adultos. Os infectados desenvolvem sintomas bastante severos como anemia aguda, complicações respiratórias e malária cerebral, muitas vezes resultando na morte do hospedeiro. Nestes países subdesenvolvidos, as mulheres grávidas pertencem a um grupo de risco sendo altamente susceptíveis à doença e, quando infectadas, podem desenvolver um vasto leque de sintomas desde anemia severa a complicações no crescimento intrauterino. Todos estes sintomas levam a complicações no desenvolvimento fetal, resultando numa elevada taxa de abortos e nascimentos precoces o que terá, futuramente, um impacto na longevidade da criança devido ao reduzido peso e aos problemas no desenvolvimento. A doença é causada por um protozoário do género Plasmodium, injectado na circulação do hospedeiro quando um mosquito infectado (vector) do género Anopheles toma uma alimentação de sangue. Os esporozoítos, após entrarem em circulação, viajam rapidamente para o fígado onde vão desenvolver-se e multiplicar-se, naquela que é conhecida como a fase não sintomática da doença. Depois de 8 a 12 dias de maturação e multiplicação dentro dos hepatócitos, os parasitas (merozoítos) são libertados em circulação, infectando eritrócitos, iniciando assim a fase sintomática da doença. Na fase eritrocitária, o parasita continua a multiplicar-se e a maturar atingindo o estadio de esquizonte que, devido ao seu elevado número, vai promover a lise dos eritrócitos, com libertação dos merozoítos em circulação, capazes de infectar novos eritrócitos. Alguns parasitas diferenciam-se em gametócitos que são colectados por mosquitos, onde vão realizar a fase sexuada completando, posteriormente, o ciclo de vida. Dentro dos eritrócitos, o parasita é capaz de promover a expressão dos seus antigénios na superfície da célula, sendo muitos deles responsáveis por promover a adesão dos eritrócitos infectados ao endotélio vascular e ao tecido de vários órgãos, num processo designado por sequestração (sequestration). Estes mecanismos de adesão são um factor de virulência do parasita que permitem que este consiga evitar o sistema imunitário e a remoção pelo baço. Durante a gravidez, a placenta constitui um nicho favorável para a acumulação do parasita, que é capaz de aderir aos trofoblastos (células da placenta de origem fetal). P. falciparum (estirpe de Plasmodium mais virulenta em humanos) liga-se a um glicosaminoglicano, nomeadamente o sulfato de condroitina A, existente em receptores expressos na placenta, por intermédio de uma proteína de adesão designada por var2CSA. A acumulação de parasita na placenta leva à produção de quimiocinas e citocinas pro-inflamatórias que vão levar ao recrutamento de células do sistema imunitário para o local da infecção. A coagulopatia, deposição de fibrina e supressão da sua degradação, em conjunto com o perfil pro-inflamatório vão contribuir para a patologia placentária, promovendo defeitos na microcirculação e no transporte de nutrientes que terão impacto no desenvolvimento e crescimento fetal. A placenta é um órgão fundamental cujo desenvolvimento e função devem ser preservados. Este órgão é responsável pelas trocas de gases e nutrientes entre a mãe e o feto, conferindo ainda tolerância contra o sistema imunitário materno e protecção física e imunológica contra patogénios, assegurando a sobrevivênvia e o desenvolvimento do feto. A grande maioria das complicações que podem ocorrer na gravidez resultam de insuficiência placentária causada por defeitos na vascularização da placenta que podem levar ao reduzido fluxo de sangue que terá futuras consequências no desenvolvimento fetal. Um trabalho publicado pelo laboratório (de Moraes et al., 2013) mostrou que os trofoblastos são capazes de controlar o fluxo sanguíneo abrindo e fechando espaços de circulação materna sugerindo que estas células provavelmente serão capazes de responder a factores de vasomodulação. Um grande número de trabalhos reportou que os trofoblastos, embora não tendo uma origem vascular, expressam um enorme reportório de factores ligados à angiogénese e à vasomodulação, os quais têm um profundo impacto na placentação, mantendo a homeostasia e a pressão sanguínea normalizada na perfusão utero-placentária. Tendo em conta que a desregulação destes factores leva a um fluxo sanguíneo insuficiente que terá consequências no desenrolar da gravidez, formulámos a hipótese de que a infecção causada pelo parasita terá impacto na regulação da expressão destes factores. Trabalhos anteriores mostraram que os níveis de mRNA do gene Bdkrb2 (gene do receptor da bradicinina 2, B2R) e do gene Nos3 (sintetase de óxido nítrico endotelial, eNOS) estão reduzidos em placentas infectadas, assim como os níveis de quininogéneo (precursor da bradicinina) sugerindo que a infecção afecta mecanismos de vasomodulação ligados à via de sinalização do B2R pela bradicinina. Os factores quantificados pertencem ao sistema das calicreinas-quininas (kallikrein-kinin system, KKS), um sistema de sinalização celular pleiotrópico. As quininas (como é o caso da bradicinina), contêm actividade bioquímica exercida após ligação ao seu receptor. Este tipo de sinalização pode resultar num vasto tipo de respostas desde vasodilatação e permeabilização vascular à resposta inflamatória. As quininas, geradas a partir da conversão proteolítica do quininogéneo por uma quininase designanda por calicreina, vão exercer determinadas funções biológicas consoante o tipo de receptor a que se ligam. São conhecidos dois receptores associados a esta cascata de sinalização: o receptor do tipo 1 (B1R), cuja expressão é induzida em resposta a alterações do sistema imunitário, participando na resposta inflamatória e na sensação de dor; e um receptor do tipo 2 (B2R), expresso constitutivamente em muitos tipos celulares (maioritariamente em células endoteliais) que, quando activado, promove vasodilatação, permeabilidade vascular e impede a agregação de plaquetas. O B2R, após activação, induz a mobilização de cálcio intracelular que promove a activada da sintetase de óxido nítrico endotelial, produtora de óxido nítrico, um potente vasodilator, exercendo o relaxamento do músculo liso levando ao aumento da vasodilatação e consequente redução da pressão sanguínea (hipotensão). Este factores foram mencionados como tendo a expressão aumentada durante a gravidez, sugerindo a importância da vasodilatação durante o decorrer da gestação. Também a expressão das enzimas e receptores constituintes desta via, foi documentada como estando desregulada nos trofoblastos em doenças em que ocorrem complicações na gravidez. Defeitos na sinalização via B2R podem promover vasocontrição e oclusão dos espaços de circulação materna na placenta, explicando o reduzido fluxo sanguíneo, a insuficiêcia placentária e as restrições no desenvolvimento fetal. De modo a testar esta hipótese, utilizámos um modelo animal (murganho) de malária placentária para avaliar os níveis de expressão do B2R em trofoblastos isolados de placentas infectadas com P. berghei. A expressão do receptor não foi significativamente alterada em trofoblastos isolados no final da gestação. Verificámos, um aumento significativo na expressão do B2R numa subpopulação de trofoblastos que, naturalmente, já expressava níveis consideráveis do receptor. Tendo em conta que, na placenta, uma enorme quantidade de factores maternos, fetais e do parasita podem afectar os níveis de expressão do receptor, crescemos e purificámos, em cultura, trofoblastos isolados de placentas não infectadas que foram, posteriormente, inoculados com eritrócitos infectados com parasita. As condições de cultura foram as seguintes: trofoblastos co-cultivados com eritrócitos não infectados ou infectados com P. berghei durante duas horas; adicionalmente, para avaliar se a presença do parasita é necessária para induzir a modulação do B2R, criámos outra condição experimental em que as células, após serem infectadas, foram incubadas com meio por um período adicional de duas horas. Estas duas horas de incubação com o parasita foram suficientes para reduzir os níveis de expressão do B2R, o efeito que parece ser prolongado até duas horas após remoção dos eritrócitos infectados. O aumento do número de células a expressar o receptor apenas foi observado durante o período de incubação adicional sem parasita. Os nossos resultados sugerem que a presença do Plasmodium leva à modulação do B2R e que este efeito pode ter consequências na vasomodulação dos espaços de circulação materna na placenta, reduzindo a vasodilatação, consequentemente promovendo a redução do fluxo sanguíneo, a insuficiência placentária e o reduzido desenvolvimento fetal