Produção de compostos antimicrobianos em solos supressivos: efeito da diversidade nutricional

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016Pseudomonas spp. e Streptomyces spp. são microrganismos frequentemente encontrados em abundância em solos supressivos. A diversidade e a limitação de nutrientes têm sido sugeridas como possíveis fatores que influenciam o surgimento de fenótipos antagonistas destas bactérias presentes em solos supressivos. O primeiro objetivo deste trabalho foi estudar o efeito de diferentes fontes de carbono (Glucose, Sacarose, Maltose, Manitol ou Xilose) em três concentrações (1%; 0,4% ou 0,04%) no aparecimento de novos fenótipos em Streptomyces sp. e Pseudomonas spp. Com consequente alteração do perfil de atividade antagonista. O segundo objetivo foi estudar a dinâmica co-evolutiva num ensaio à escala laboratorial de modo a verificar a influência da co-cultura na alteração de fenótipos de duas espécies. Utilizaram-se diversas estirpes isoladas de diferentes solos referenciadas como estirpes produtoras de compostos com atividade antimicrobiana (Pseudomonas fluorescens CG2013; P. jessenii 13 A; P. kilonensis 3 A; P. kilonensis CAP1; P. migulae 13 B; P. putida CAP4 e Streptomyces sp.). Foram realizados ensaios de interação entre microrganismos, em meio de cultura sólido com as diferentes fontes de carbono e concentrações. Os resultados foram expressos qualitativamente (inibição, redução ou sem efeito no crescimento) e convertidos quantitativamente de modo a realizar análises estatísticas (ANOVA com um, dois e três fatores). De um modo geral, verificou-se que tanto a fonte de carbono, como a concentração e a estirpe de bactéria produtora tiveram influência na inibição de estirpes bacterianas e fúngicas, assim como as diferentes interações entre esses três fatores. Foi realizado um ensaio de co-evolução à escala laboratorial, simulando um microcosmo em mono e em co-cultura, com duas estirpes de Pseudomonas (P. kilonensis CAP1 e P. putida CAP4) em meio de cultura BSM suplementado com Manitol, Xilose ou ambos. Ao longo do tempo foram realizados ensaios de interação entre as estirpes produtoras e estirpes indicadoras. De uma forma geral, verificou-se que o número de gerações, o inóculo de estirpes produtoras e a interação entre esses fatores influenciaram significativamente a atividade antimicrobiana sobre B. subtilis. Os resultados obtidos sugerem que houve influência da dinâmica co-evolutiva na alteração dos fenótipos de P. kilonensis CAP1 e P. putida CAP4 uma vez que a co-cultura (em manitol e manitol com xilose) após 70 gerações apresentou maior efeito antagonista do que as estirpes em mono cultura.Pseudomonas spp. and Streptomyces spp. are frequently found in high quantities in suppressive soils, and may have a key role in determining their pathogenic suppressive soil characteristics. Diversity and limitation of nutrients have been suggested as possible factors that influence the emergence of antagonist’s phenotypes of bacteria in suppressive soils. The first aim of this work was to study the effect of different carbon sources (Glucose, Saccharose, Maltose, Mannitol or Xylose) in three concentrations (1%; 0.4% or 0.04%) and its contribution to the expression of new phenotypes exhibited by Streptomyces sp. And Pseudomonas spp. with amendment of antagonist activity profile. The second aim was to study the co-evolutionary dynamics in a laboratory scale in order to verify the effect of co-culture in changing phenotypes of two species with different antagonist’s activities. We used several strains isolated from agricultural soils referred as producer strains of compounds with antimicrobial activity (Pseudomonas fluorescens CG2013; P. jessenii 13 A; P. kilonensis 3 A; P. kilonensis CAP1; P. migulae 13 B; P. putida CAP4 e Streptomyces sp.). Co-culture interactions were conducted between antimicrobial producer and susceptible strains (bacteria and fungi) in solid culture media with each carbon source at different concentrations. The results were expressed qualitatively (inhibition, reduction or non effect on growth) and quantitatively converted to perform statistical analysis. In general, it was found that factors such as carbon source, concentration and antimicrobial producer strain have influence on the inhibition of bacterial and fungal strains, as well as the different interactions of these three factors. The co-evolutionary dynamics in a laboratory scale was conducted simulating a microcosm in mono and co-culture with two strains of Pseudomonas (P. kilonensis CAP1 e P. putida CAP4) in BSM culture medium supplemented with Mannitol, Xylose or both. Over time interactions tests were conducted between the antimicrobial producer and susceptible strains. In general, it was found that the number of generations, the antimicrobial producer strain and the interaction among these factors significantly influence the antimicrobial activity against B. subtilis. The results suggest an influence of the co-evolutionary dynamics in changing P. kilonensis CAP1 e P. putida CAP4 phenotypes, since that co-culture (in Mannitol and Mannitol with Xylose) after 70 generations had higher antagonistic effect than the strains in mono-culture. Overall, these results suggest that antagonistic microbial and co-evolution interactions among microorganisms can play an important role in biological control of plant disease in suppressive soils