Chemical characterization of Cynara Cardunculus var. Scolymus and its application in topical formulations

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016Cynara Cardunculus var. Scolymus, usualmente conhecida por alcachofra, é uma espécie pertencente à família Asteraceae e é característica da região Mediterrânea, sendo um dos vegetais amplamente consumidos nessa região. Assim, esta espécie representa uma importante fonte de rendimentos para a agricultura e economia dos países mediterrâneos, sendo Espanha, França, Itália e Grécia responsáveis por mais de 45% da produção mundial de alcachofra. A alcachofra é maioritariamente composta por água, proteínas, lípidos, hidratos de carbono, inclusive inulina, fibras e açucares, mas também apresenta na sua constituição minerais e vitaminas. Esta espécie é ainda altamente rica em polifenóis, especialmente em derivados de ácido cafeoilquínico, como é o caso do ácido clorogénico (3-O-ácido cafeoilquínico) e da cinarina (1,3-ácido cafeoilquínico), e ainda em flavonoides como o cinarósido (7-O-glucósido de luteolina). Estes são responsáveis pela atividade antioxidante associada à alcachofra, sendo que quanto maior o seu conteúdo em polifenóis, maior a sua capacidade antioxidante. Para além da sua atividade antioxidante, a alcachofra é conhecida pelas suas amplas propriedades terapêuticas: colerética, hepatoprotetora, anticarcinogénica, antibacteriana, antifúngica, anti-inflamatória e anti envelhecimento. Os compostos bioativos presentes em tecidos vegetais, tais como os polifenóis, são extraídos através de inúmeras técnicas, sendo que este processo depende de diversos fatores, como é o caso do pH, solubilidade, tempo de extração e temperatura. A escolha do método de extração é fundamental e de extrema importância uma vez que influencia a taxa de extração, o rendimento e a pureza dos compostos extraídos. A infusão é um método de extração convencional, no qual as folhas da espécie em causa são introduzidas em água a ferver por um curto período de tempo, sendo o tempo de extração e a temperatura os parâmetros com maior impacto. Estes métodos de extração resultam em frações com elevado nível de impureza. Assim, a purificação dos extratos através da remoção de materiais maioritariamente inertes é uma opção que visa a obtenção de frações com propriedades melhoradas, incluindo a atividade antioxidante. A digestão ácida com suco gástrico seguida de uma diálise e a precipitação de mucilagens presentes nos extratos vegetais são duas estratégias de purificação. A aplicação destes compostos em produtos cosméticos tem vindo a aumentar devido à proibição de utilização de ingredientes de origem animal e à procura de produtos naturais e sustentáveis. As formulações tópicas que têm por base extratos de origem vegetal têm como principais funções a proteção da pele contra efeitos exógenos e endógenos prejudiciais, e a manutenção do equilíbrio hidrolipídico da pele. E estas podem ser líquidas, tais como suspensões, soluções ou emulsões, ou semissólidas, como é o caso de pomadas, cremes e geles. As formulações semissólidas são preferíveis, dado que os ingredientes bioativos quando incorporados nestas podem ter ação nas camadas mais superficiais ou nas camadas mais profundas da pele, dependendo das características físico-químicas dos ingredientes bioativos e da finalidade das formulações, e ainda devido ao seu comportamento reológico. A qualidade, segurança e eficácia destes produtos são avaliadas através de diversos parâmetros físico-químicos, como o pH, homogeneidade e textura, através controlo microbiológico e estudos de irritabilidade cutânea, de citotoxicidade e de estabilidade, e ainda por parâmetros biométricos, tais como perda transepidérmica de água, hidratação, reforço da barreira cutânea, elasticidade, entre outros. O objetivo deste trabalho foi estudar as propriedades antioxidantes do extrato de alcachofra e a sua utilização como ingrediente para produtos cosméticos antioxidantes. O presente estudo utilizou folhas de alcachofra, as quais foram submetidas a um processo de infusão, de filtração e liofilização com o intuito de extrair e estabilizar o extrato de alcachofra. A caracterização do extrato de alcachofra foi realizada através de métodos de quantificação específicos e revelou que este é constituído por 62.8% de fibras dietéticas solúveis e insolúveis, 3 % de polifenóis, 0.82% de hidratos de carbono e 0.002% de proteínas. Duas estratégias de purificação foram adotadas visando o melhoramento das atividades antioxidantes do extrato de alcachofra: digestão ácida seguida de uma diálise com duração de 24 horas que resultou na fração A, e precipitação de mucilagens, na qual se testou ainda a importância da utilização de ácido acético, que resultaram nas frações B (utilização de ácido acético) e C (ausência de ácido acético). Os extratos aquosos procedentes das purificações, bem como o extrato aquoso de alcachofra, foram analisados através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-DAD) com o intuito de acompanhar os processos de purificação e de dosear a cinarina, o ácido clorogénico e o cinarósido presente em cada fração. Estes compostos foram identificados em todas as frações estudadas, sendo que o extrato de alcachofra demonstrou ser o mais rico. A atividade antioxidante de todas as frações foi avaliada através do ensaio com o radical livre 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Todas as frações apresentaram atividade antioxidante, sendo que a fração que apresentou o melhor resultado foi a fração C, resultante da precipitação de mucilagens sem a utilização de ácido acético, com um EC50 de 56 μg/mL. O extrato de alcachofra e a fração C foram estudados de forma mais detalhada. A sua atividade antioxidante foi ainda avaliada através de ensaios in vitro em queratinócitos, nos quais foram utilizados como agentes oxidativos o peróxido de hidrogénio e radiação UV. Ambas as frações não apresentaram diferenças significativas relativamente ao ácido ascórbico no caso da radiação UV, mas apresentaram ligeiras diferenças no caso do peróxido de hidrogénio. O fator de proteção solar (FPS) foi determinado, tendo-se obtido um FPS de 10.99 para o extrato de alcachofra e 10.20 para a fração C. A citotoxicidade foi também avaliada e apesar de se ter observado redução da viabilidade celular, os extratos foram considerados seguros. Ambas as frações foram incorporadas em dois tipos de formulações tópicas: emulsões O/W e geles. Ambas as formulações foram desenvolvidas com a máxima simplicidade possível, tendo-se utilizado apenas os ingredientes essenciais de forma a diminuir possíveis efeitos secundários provocados por algum ingrediente presente. Para cada formulação foi realizada uma caracterização físico-química (pH, viscosidade), e um controlo microbiológico. O pH ligeiramente acídico, entre 5.4 e 6.4, as propriedades reológicas e a quase total ausência de fungos e bactérias nos produtos cosméticos desenvolvidos, revelaram que estes são adequados e seguros para o uso tópico. Nos ensaios de citotoxicidade das formulações em queratinócitos observou-se uma diminuição da viabilidade celular associada às formulações que continham os ingredientes bioativos relativamente aos seus respetivos brancos. A nível da integridade membranar, apenas os cremes revelaram diferenças significativas quando comparados com o seu branco. Assim, as formulações foram consideradas biocompatíveis e seguras para o uso tópico. Tendo em conta os resultados dos estudos in vitro e os custos e tempo de produção de cada fração (extrato de alcachofra e fração C), foi decidido testar apenas as formulações contendo o extrato de alcachofra nos seguintes estudos in vitro e nos estudos in vivo. As atividades antioxidantes das formulações com o extrato de alcachofra incorporado foram avaliadas através de ensaios in vitro em queratinócitos, nos quais se utilizou peróxido de hidrogénio e radiação UVB como indutores de stress oxidativo. Os resultados demonstraram que ambas as formulações, creme e gel, apresentam atividades antioxidantes elevadas. Nos estudos in vivo, foram realizados um Human Repeat Insult Patch Testing (HRIPT) e um ensaio para determinar o efeito de proteção das formulações contra stress oxidativo induzido por radiação UV. Os resultados demonstraram que ambas as formulações, o creme e o gel, apresentam uma boa compatibilidade cutânea, e que apesar de ambas as formulações possuírem a capacidade de diminuir a atividade oxidante provocada pela radiação UVA, apenas o gel de alcachofra demonstrou uma atividade antioxidante verdadeira. O processo de infusão demonstrou ser um método eficaz na extração de polifenóis da alcachofra. O mesmo ocorreu para os processos de purificação realizados, uma vez que estes conseguiram melhorar as atividades antioxidantes de cada fração, mesmo daquelas com um menor conteúdo de polifenóis. Através de ensaios in vitro, as formulações desenvolvidas com os extratos eleitos revelaram ser adequadas e seguras para o uso tópico. Posteriormente, estudos in vivo também demonstraram que estas formulações eram dermatologicamente seguras, uma vez que não apresentaram reações adversas na pele nem potencial efeito alergénico. Para além disso, estes estudos comprovaram de novo o potencial antioxidante da alcachofra, sendo que o gel que continha o extrato de alcachofra apresentou atividade antioxidante in vivo. Este estudo demonstrou assim o potencial da alcachofra para ser introduzido em produtos cosméticos com finalidades antioxidantes e anti envelhecimento.Cynara Cardunculus var. Scolymus, usually known as artichoke, is a Mediterranean specie with therapeutic properties, including antioxidant activity. This plant is a rich source of polyphenols, including caffeoylquinic and dicaffeoylquinic acids. The use of bioactive ingredients or phytochemicals extracted from plant tissues in cosmetics is increasing, thus artichoke extract due to its constituents can be incorporated in topical formulations. The artichoke extract used in this study was obtained through an infusion technique, a conventional method in which dried leaves are placed in boiling water for a short period of time. Aqueous artichoke extract was characterized by high-performance liquid chromatography–diode array detector and a quantification of several constituents present in it, like proteins, carbohydrates, polyphenols and dietary fibers, was performed. Two purification strategies were adopted, including a gastric digestion followed by a dialysis that resulted in artichoke fraction A and a mucilage precipitation method. In this last method, two different assays were performed, one using acetic acid and the other without the use of acetic acid, resulting in artichoke fractions B and C, respectively. The purify fraction with higher polyphenols content was artichoke fraction C, which was chosen among all. The content of total phenols and tannins were determined along the purification processes, as well as the antioxidant activity. Artichoke Extract and Artichoke Fraction C were subjected to ROS scavenging activity and MTT cytotoxicity assays in HaCaT cell lines, being both good antioxidants and non-toxic. Sun protection factor (SPF) was also measured in both fractions and the artichoke extract showed the highest SPF. These fractions were incorporated in O/W emulsions and hydrogels for topical application. Chemical and physical characterization and microbiological control, as well as cytotoxicity and membrane integrity assays, were performed on the products to ensure their quality and safety. The formulations containing the artichoke extract were considered the best choice according with the in vitro studies realized and the costs and time of production of each fraction, so these were chosen to proceed with the study. ROS scavenging activity assays of the formulations containing artichoke extract showed powerful antioxidant activities. In vivo studies, including a human repeat insult patch testing (HRIPT) and an assessment of the protective effect against oxidative stress after UV radiation by chromameter evaluation, showed very good skin compatibility and no allergenic potential for all formulations, and according to the antioxidant activity assay, the artichoke gel was the formulation that presented a true in vivo antioxidant activity. The aim of this study was to investigate the antioxidant properties of artichoke extract in topical formulations