Revisiting Vitis vinifera subtilase gene family: links to grapevine resistance against Plasmopara viticola

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016Proteases do tipo subtilisina, também conhecidos por subtilases, são uma família de proteínas muito diversa e a segunda maior dentro das peptidases de serina, e que existe nos mais variados organismos. Nas plantas, as subtilases são especialmente abundantes, como por exemplo, em Oryza sativa (arroz) são conhecidos 63 genes, em Arabidopsis thaliana são conhecidos 56 genes e em Lycopersicum esculentum (tomate) estão presentes pelo menos 15 genes. Estes proteases funcionam como enzimas secretores e são direcionados para a retículo endoplasmático migrando depois para a membrana plasmática da célula. A maioria dos subtilases são sintetizados como pré-pro-proteínas precursoras inativas, apresentando um péptido sinal, um pró-domínio (domínio inibidor I9), um domínio subtilase (domínio peptidase S8) e um domínio associado a proteases (PA, protease-associated) localizado no interior do domínio S8. Curiosamente, alguns subtilases podem ter apenas um ou dois destes domínios ou até domínios adicionais. Os subtilases apresentam uma tríade catalítica extremamente conservada localizada dentro do domínio S8 peptidase, constituída por um resíduo de aminoácido de aspartato (Asp), um de histidina (His) e um de serina (Ser), podendo alguns subtilases apresentar também um outro resíduo catalítico conservado de asparagina (Asn) dentro do mesmo domínio. Normalmente, os subtilases de plantas apresentam uma estrutura monomérica, apesar de vários estudos sugerirem que muitos deles possam sofrer uma homo-dimerização mediada pelo domínio associado a proteases (PA) de modo a serem ativados. Uma outra característica destes proteases é a aparente independência de cálcio (Ca2+), contrariamente ao que é conhecido para outros proteases. Em plantas, os subtilases estão envolvidos nas mais diversas funções biológicas, desde a mobilização de proteínas de armazenamento durante a germinação de sementes, até à iniciação de programas de senescência e morte celular. Evidências recentes realçaram também a participação de subtilases na resposta a estímulos ambientais bióticos e abióticos, bem como nas interações simbióticas das plantas com outros organismos. Em 1987 foi demonstrado pela primeira vez o envolvimento de subtilases na resposta de defesa em plantas através da identificação da acumulação de um subtilase, o P69, nas folhas de tomate após infeção com o viroide citrus exocortis. Mais recentemente, estudos em Arabidopsis thaliana identificaram o gene SBT3.3 cuja expressão aumenta muito rapidamente durante a ativação da resposta imune inata, seguida da ativação de genes de resposta ao ácido salicílico (SA). Outros estudos demonstraram também que os subtilases são glicosilados e secretados para a matriz extracelular da planta. Uma vez que é nesta matriz que acontece a primeira interação hospedeiro-patogénio, o respetivo reconhecimento e consequente sinalização, a acumulação de subtilases neste espaço extracelular pode ter um papel importante durante a patogenicidade. Recentemente foi relatada a expressão constitutiva de um subtilase numa videira resistente e um aumento da expressão desta proteína após inoculação com o oomycete Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni, o agente causador do míldeo em videira (Vitis vinifera). Este subtilase apresenta elevada homologia com o P69 de tomate. Apesar de recentemente várias hipóteses serem colocadas relativamente à presença e importância das subtilases em Vitis vinifera, estas proteínas ainda não foram associadas com a resposta imunitária da videira, particularmente contra o Plasmopara viticola. Uma vez que as videiras cultivadas (Vitis vinifera L.) são atualmente a mais importante planta de fruto cultivada em todo o mundo e altamente suscetível a várias doenças incluindo o míldio causado pelo P. viticola, a importância das subtilases na resistência deve ser explorada. Em 2014, a família de subtilases em Vitis vinifera foi preliminarmente caracterizada. Simultaneamente, uma nova anotação do genoma de videira foi publicada, havendo genes que deixaram de ter anotação e outros que mudaram de nome. Assim, o principal objetivo deste projeto foi realizar uma re-caracterização genómica da família de subtilases de videira, tomando como referência a re-anotação do genoma de videira que ocorreu em 2014, e associar alguns desses genes com a resposta de defesa da Vitis vinifera contra o Plasmopara viticola. Para cumprir este objetivo, foram realizadas pesquisas em bases de dados considerando os três domínios conservados característicos de subtilases (domínios peptidase S8, PA e inibidor I9), que conduziram à identificação de 85 genes de subtilases em videira, desigualmente distribuídos ao longo de 15 dos 19 cromossomas da videira. Verificou-se que estes genes codificam 97 possíveis proteínas (resultantes de eventos de splicing alternativo). Estes subtilases foram organizadas em 6 grupos de acordo com a semelhança entre a sequência das proteínas, resultante de uma análise filogenética. Uma análise a nível da localização subcelular demonstrou que a maioria dos subtilases de videira estão localizados no apoplasto, na parede celular ou na região extracelular. A comparação dos subtilases de videira com subtilases de Arabidopsis thaliana e Solanum lycopersicum demonstrou que, uma elevada percentagem dos mesmos, partilham grande semelhança de sequência com os subtilases SBT3.3 e P69. Estes proteases já tinham sido anteriormente relacionados com a resposta de defesa da Arabidopsis e do tomate, respetivamente, contra estímulos ambientais bióticos. Para além disso, foi demonstrado neste estudo que alguns genes de subtilases em videira estão localizados perto de genes associados à resistência da Vitis vinifera contra o Plasmopara viticola. O segundo objetivo deste projeto foi realizar estudos de expressão de genes de forma a elucidar a participação de subtilases de videira anteriormente selecionadas na resistência da Vitis vinifera contra o Plasmopara viticola. Esta expressão foi analisada em duas cultivares de V. vinifera (Regent e Trincadeira) após inoculação com o oomycete Plasmopara viticola. Para além disso, o padrão de expressão constitutivo destes subtilases foi analisado em várias espécies selvagens de Vitis e cultivares de Vitis vinifera que apresentam vários graus de resistência quando infetadas com o P. viticola. Os resultados sugeriram que, sob ataque do patogénio, as cultivares resistentes têm uma rápida resposta através do aumento da expressão de alguns subtilases. Este rápido aumento pode estar relacionado com o estabelecimento imediato de uma estratégia defensiva contra o patogénio invasor. Por outro lado, a cultivar suscetível demonstrou um atraso no aumento da expressão de subtilases, que pode estar relacionado com a sua tentativa de iniciar uma estratégia defensiva, mas que não é rápida nem robusta o suficiente para prevenir a invasão e o crescimento do patogénio. Ao nível constitutivo, em várias espécies e cultivares de videira não foi observado um padrão de expressão de subtilases. Ambos os resultados sugerem que existe uma expressão diferencial de certos subtilases nas espécies resistentes, mas esta só acontece após estimulação da planta com o ataque do patogénio, o que suporta a hipótese de que alguns subtilases de videira podem ter um papel importante na resposta de defesa contra o Plasmopara viticola. Em último lugar, dois subtilases de videira foram selecionados com base nas suas características e nos seus perfis de expressão e foram clonados com o intuito de expressar a respetiva proteína recombinante. Do que se sabe até agora, este estudo é o primeiro a realizar uma caracterização em larga escala de subtilases de videira associados à resposta de imunidade contra o patogénio responsável pelo míldeo. Estudos futuros serão realizados com o intuito de caracterizar as proteínas recombinantes, elucidar respetivas estruturas e identificar possíveis substratos, a fim de estabelecer estes subtilases como candidatos para a introgressão de genes em programas de melhoramento.Subtilisin-like proteases, also known as subtilases, are a very diverse family of serine peptidases present in many organisms. In plants, subtilases are especially abundant with, e.g., 63 known genes in Oryza sativa, 56 genes in Arabidopsis thaliana and 15 in Lycopersicon esculentum. These proteins act as secretory enzymes and are targeted to the endoplasmic reticulum migrating to the cell plasma membrane. The majority of plant subtilases are synthesized as an inactive pre-pro-protein precursor formed by a signal peptide, a pro-domain (I9 inhibitor domain), a subtilase (S8 peptidase) domain, and a protease-associated (PA) domain located within the subtilase domain. Moreover, some of them may have only one or two of these domains or even additional domains. Subtilases present a highly conserved catalytic triad within the S8 peptidase domain, constituted by aspartate (Asp), histidine (His) and serine (Ser) amino acid residues, and some subtilases may have also a conserved catalytic asparagine (Asn) residue. Concerning protein structure, plant subtilases are generally monomeric, although several studies have indicated that many subtilases suffer a homo-dimerization mediated by PA domain in order to become activated. In plants, subtilases are involved in many biological functions from the mobilization of storage proteins during seed germination to the initiation of cell death and senescence programs. Recent evidences have also highlighted the participation of subtilases in response to biotic and abiotic environment stimulus and in symbiotic interactions of plants with other organisms. In 1987 was demonstrated for the first time the involvement of subtilisin-like proteases in plant defence response with the identification of subtilase P69 accumulation in tomato leaves after the infection with citrus exocortis viroid. More recently, studies in A. thaliana identified the SBT3.3 gene which expression rapidly increases during the activation of innate immunity preceding the activation of salicylic acid (SA) responsive genes. Studies have also shown that subtilases are glycosylated and secreted to the plant extracellular matrix (ECM). Since ECM is where the first host-pathogen interactions, recognition and signalling events take place, the accumulation of subtilases in this cellular location may account for an important role during pathogenesis. Recently, was reported a constitutively expression of a subtilisin-like protein, sharing high sequence similarity with the tomato subtilases P69C, in a resistant grapevine and an increase of protein expression after inoculation with the oomycete Plasmopara viticola. Besides these clues of the presence and importance of the subtilases in V. vinifera, these proteins were not yet associated with grapevine immune responses particularly concerning P. viticola resistance. As cultivated grapevine (Vitis vinifera L.) is currently the most important fruit plant cultivated worldwide and highly susceptible to several disease including downy mildew, caused by Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni, the importance of subtilases in resistance should be further investigated. In 2014, the subtilase family in Vitis vinifera was preliminarily characterized but at the same time a new annotation of the grapevine genome was published. Thus, the main purpose of this project was perform a genome-wide update of the grapevine subtilase gene family and associate some subtilase genes with the defence response of the V. vinifera against the P. viticola, taking as reference the grapevine genome reannotation that occurred in 2014. For that, several database searches were performed considering the three domains (S8, PA and I9) leading to the identification of 85 grapevine subtilase genes, unevenly distributed among 15 of the 19 grapevine chromosomes. From these genes, it was predicted to obtain 97 subtilase proteins, which were organized into 6 groups accordingly with their similarity. An analysis at subcellular location level, showed that the majority of the grapevine subtilases were located in apoplast, cell wall or extracellular region. Comparison of the grapevine subtilases with Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum subtilases showed that a high percentage of them shared high sequence similarity with SBT3.3 and P69C subtilases. These proteases have been already related to the defence response of Arabidopsis and tomato, respectively, against biotic environment stimulus. Moreover, it was demonstrated in this study that some grapevine subtilases genes were located near of locus associated to Vitis vinifera resistance against Plasmopara viticola. The second goal of this project was performed gene expression studies elucidating the role of selected grapevine subtilases in the grapevine resistance against P. viticola. Subtilase gene expression was studied in two Vitis vinifera cultivars (Regent and Trincadeira) after P. viticola inoculation and the constitutive expression pattern of the subtilases was studied in several grapevine species/ cultivars showing varying degrees of resistance towards P. viticola. The results suggested that under pathogen attack, resistant grapevine cultivar have an early response increasing the expression of some subtilases. This early increase of subtilase expression may be related to the establishment of a defence strategy against the invading pathogen. On the other hand, the susceptible grapevine cultivar showed a delay of the subtilase expression increase, which may be related to an attempt by the susceptible cultivar to initiate a defence strategy that was not fast or robust enough to prevent pathogen growth. At a constitutive level, in several grapevine species/ cultivars, it was not observed a pattern of subtilases expression. Both results suggest that there was a differential expression of certain subtilases in resistant species but only after stimulation with the pathogen attack, which supports the hypothesis that some grapevine subtilases may have a role in defence response against P. viticola. Finally, two subtilases were selected, based on their characteristics and on expression profiles, and cloned for recombinant protein expression. Up to our knowledge, this study is the first to preformed a large scale characterization of grapevine subtilases associated to immune responses against the downy mildew pathogen. Further studies in order to characterize the recombinant proteins, to access their structure and substrates should be done in order to establish these subtilases as candidates for introgression in breeding programs