Mecanismes moleculars i efecte terapèutic antiangiogènic del pèptid R3(178-210) en un model ortotòptic de càncer de mama

La via de Calcineurina (Cn)- Factor Nuclear de Cèl·lules T Activades (NFAT) ha estat descrita clàssicament com a via de senyalització essencial en el funcionament de les cèl·lules T del sistema immunològic i amb els NFATc com a factor de transcripció clau en la resposta immunitària contra els òrgans trasplantats. Actualment s'usen fàrmacs com la Ciclosporina A i el FK506 per a inhibir la calcineurina i la conseqüent activació de NFAT en teràpies immunosupressores per al tractament del rebuig d'òrgans. Aquests fàrmacs, però, inhibeixen la totalitat d'activitat fosfatasa de la calcineurina de manera que no només la via Cn-NFAT en resulta afectada. Com a conseqüència, el tractament amb aquests fàrmacs porta associat tota una llista d'efectes secundaris indesitjats. La proteïna RCAN3 sencera i/o el pèptid RCAN3178-210 (pèptid derivat de la proteïna RCAN3, aminoàcids 178-210) inhibeixen específicament la via de Cn-NFATc mitjançant competició de RCAN3 amb NFATc per unir-se a calcineurina mitjançant un motiu aminoacídic similar en les dues proteïnes anomenat PxIxIT. RCAN3, per tant, pot ser un regulador específic i, el més important, endogen de la via Cn-NFAT. Donat que els factors de transcripció NFATc estan implicats en varis processos del desenvolupament tumoral (pàncrees, pell, mama), l'objectiu principal d’aquest treball és determinar l’efecte biològic i funcional de la sobreproducció de RCAN3 i del pèptid R3178-210 que conté el motiu PxIxIT com a inhibidor de la via de Cn-NFATc en la progressió tumoral i avaluar la possibilitat d’usar aquesta proteïna o pèptid, o derivats o mimètics d’aquests, en el tractament de la progressió tumoral i metàstasi en el càncer de mama humà triple negatiu (TNBC) usant ratolins com a models ortotòpics d'aquest tipus de càncer. La hipòtesi d'aquest treball és que RCAN3 i el pèptid CIC inhibeixen la progressió tumoral mitjançant la inhibició de la via de Cn-NFATc i serien per se possibles nous agents terapèutics antitumorals. Els resultats indiquen que la sobreproducció de RCAN3, així com el pèptid R3178-210 inhibeixen la translocació dels NFATc a nucli afectant així la transcripció de gens dependents de NFAT (com el gen proangiogènic de la Ciclooxigenasa 2 (cox-2) i el gen proinflamatori de la Interleukina 8 (Il-8)) i el nivell de producció de les corresponents proteïnes (COX-2 i IL-8). En models ortotòpics TNBC, s'ha observat una reducció significativa en el volum dels tumors que sobrexpressen RCAN3 possiblement com a conseqüència d'una alteració en l'angiogènesi tumoral. A més, aquests tumors presenten un increment en l'apoptosi cel·lular i una disminució en el número de cèl·lules en proliferació en comparació amb els tumors control. Els tumors RCAN3 també presenten una reducció en el número de cèl·lules immunitàries infiltrades en el tumor. Aquest resultat es creu que podria ser degut, entre d'altres factors, a l'efecte indirecte de la sobrexpressió de RCAN3 sobre il-8. El TNBC és un càncer que fàcilment crea metàstasis a partir d'una transició epitelio-mesenquimal (TEM) i per això s'han analitzat marcadors que s'associen a la formació de metàstasis com S100A4 i marcadors TEM com la e-cadherina i la vimentina. Els resultats indiquen que els tumors RCAN3, tot i no presentar canvis en les proteïnes epitelio-mesenquimals escollides, presenten una inhibició del marcador premetastàtic S100A4. Respecte als tumors R3178-210, s'han obtingut els mateixos resultats, tot i que amb significances una mica més modestes. Aquest fet reforça el paper clau dels aminoàcids 178-210 de RCAN3 en a la regulació endògena de la via Cn-NFAT i la seva implicació en càncer TBNC. Finalment s'ha realitzat una primera aproximació experimental per utilitzar el pèptid R3178-210 com a eina terapèutica i els resultats preliminars han sigut que, malgrat no observar reducció en el volum tumoral dels animals tractats amb el pèptid, sí que es repeteix l'efecte inhibitori sobre l'angiogènesi.The members of the human regulators of calcineurin (RCAN) protein family are endogenous regulators of the calcineurin (CN)-cytosolic nuclear factor of activated T-cells (NFATc) pathway activation. This function is due to the presence of a highly conserved aminoacidic motif in RCAN3 protein, which has been shown to compete with NFATc for the binding to CN. As a consequence, RCAN3 is able to inhibit NFATc activation by CN. Very recently, emerging roles for NFATc proteins in transformation, tumour angiogenesis and metastasis have been described in different cancer cell types. In this work, we report that the overexpression of RCAN3 dramatically inhibits tumour growth and tumour angiogenesis in an orthotopic human Triple Negative Breast Cancer mouse model. We also observed a decrease in proliferative cells and an increase in apoptotic cells compared to control tumours. We suggest that RCAN3 exerts these effects in a CN-dependent manner, as mutation of the aminoacidic motif in RCAN3 abolishes the tumour suppressor effect. Moreover, the expression of the R3178-210 peptide, spanning the motif of RCAN3, is able to reproduce all the antitumor effects of RCAN3 full-length protein. Also we show that RCAN3 and the R3178-210 peptide inhibit the CN-NFATc signalling pathway and the induction of the NFATc-dependent gene cyclooxygenase-2 and IL-8. Our work suggests that the R3178-210 peptide possess potent tumour suppressor properties and therefore constitutes a novel lead for the development of potent and specific antitumoral agents. With these results, we've done a first approach using the peptide R3178-210 as a treatment against this disease. We've treated the tumours with the peptide and we've seen that although no changes in tumour volume were observed, the effect on tumour angiogenesis repeated significantly. We propose the targeting of the CN-NFATc pathway in the tumour cells could constitute an effective way to hamper tumour progression by impairing the paracrine network among tumour, endothelial and immune tumour infiltrated cells