MALATTIE INFIAMMATORIE INTESTINALI: VALUTAZIONE DEL RUOLO DEI COMPARTIMENTI INTESTINALI NELLA RISPOSTA IMMUNO MUCOSALE NELLA MALATTIA CELIACA, ANALISI MEDIANTE LASER CAPTURE MICRODISSECTION. STUDIO DEL RUOLO DI CEPPI AIEC NELL’EZIOPATOGENESI DEL MORBO DI CROHN

Durante il percorso di dottorato è stato preso in esame il ruolo della risposta immunitaria nell'eziopatogenesi di due patologie infiammatorie intestinali: la malattia celiaca (MC) ed il morbo di Crohn. Il progetto è stato suddiviso in due parti: nella prima fase si è analizzato il ruolo dei compartimenti mucosali nella risposta immunitaria al glutine, mediante l'utilizzo di una tecnica innovativa, la microdissezione laser. Nella seconda fase si è cercato di chiarire il ruolo di ceppi patogeni AIEC di E. Coli nell'eziopatogenesi del morbo di Crohn e della risposta immunitaria ed infiammatoria che si instaura nella mucosa intestinale dei pazienti affetti dalla malattia. PARTE 1 - MALATTIA CELIACA: RUOLO DEI COMPARTIMENTI INTESTINALI NELLA RISPOSTA IMMUNE MUCOSALE La malattia celiaca (MC), o enteropatia glutine-sensibile, è un’ intolleranza permanente alle gliadine del grano ed alle prolammine corrispondenti di altri cereali, quali orzo e segale. Essa è responsabile nei soggetti geneticamente suscettibili del grave danno della mucosa intestinale. Secondo dati recentemente presentati all’Associazione Italiana Celiachia, in Italia l’incidenza di questa intolleranza è stimata in un soggetto ogni 100/150 persone. I celiaci potenzialmente sarebbero quindi 400.000, ma ne sono stati diagnosticati intorno agli 85.000. Ogni anno vengono effettuate 5.000 nuove diagnosi e nascono 2.800 celiaci, con un incremento annuo di circa il 10%. Si stima che, su circa 380.000 pazienti affetti da malattia celiaca, l’85% dei pazienti è affetto da malattia celiaca asintomatica non diagnosticata, mentre il 15% soffre di una malattia celiaca sintomatica e quindi conclamata. Di questi ultimi solo il 60% ha già ricevuto specifica diagnosi. Ne consegue che la celiachia, pur essendo una malattia nota da molti anni, solo in tempi recenti viene riconosciuta come un problema piuttosto comune e, quindi, riceve una maggiore attenzione anche da parte dei produttori di alimenti e dei ristoratori. Le Citochine Infiammatorie nella MC Nel paziente celiaco, in fase florida della malattia, l’epitelio della mucosa intestinale risulta costituito da enterociti immaturi ed è infiltrato da linfociti T CD8+ ad azione citotossica (IELs). Nella lamina propria invece, sono aumentati e attivati i linfociti T CD4+ (LPLs). I meccanismi che conducono al danno della mucosa intestinale del celiaco, sembrano in parte ascrivibili alla produzione di citochine proinfiammatorie del tipo Th1, tra cui l’interferone gamma (INF-γ), rilasciate soprattutto dai linfociti CD4+ della lamina propria . Paradossalmente l’IL-12, la citochina più coinvolta nella polarizzazione in senso Th1 della risposta immune, non è stata dimostrata nella mucosa intestinale del paziente celiaco. Altri studi dimostrano il coinvolgimento di altre citochine infiammatorie nel danno mucosale, principalmente TNF-α, IL-15 e IL-21. TNF-α (Tumor Necrosis Factor) è una citochina proinfiammatoria prodotta oltre che dai macrofagi attivati, da linfociti T e B, neutrofili, eosinofili e basofili, mastociti, cellule NK, astrociti, cellule della microglia e cellule di Kuppfer. In particolare nella MC attiva c’è un’ iperproduzione di TNF-α, principalmente da parte dei linfociti T attivati, che determina, insieme alle altre citochine proinfiammatorie, apoptosi e iperproliferazione cellulare con conseguente appiattimento della mucosa intestinale. Per quanto concerne l’IL-15, essa è presente in gran quantità nella mucosa intestinale del celiaco ed è prodotta da cellule mieloidi, cellule epiteliali ma non da cellule linfoidi (salvo in particolari condizioni), quindi non è espressione di una risposta immune T-dipendente. L’IL-15, sembra avere un ruolo importante nella patogenesi della MC in quanto, è capace di turbare l’omeostasi mucosale del paziente celiaco in differenti modi. Prodotta dall’enterocita del celiaco in seguito al contatto con il peptide 31-43, l’IL-15 induce l’espressione autocrina del MICA e dell’HLA-E sugli enterociti, e del NKG2D/CD94 sui linfociti CD8+ citotossici intraepiteliali. L’interazione tra il MICA e l’NKG2D e tra HLA-E e il CD94 trasforma i linfociti T CD8+ intraepiteliali in cellule NK, con conseguente rapida lisi delle cellule epiteliali mediante apoptosi. Recentemente nella mucosa intestinale di pazienti celiaci in fase attiva di malattia, è stata dimostrata una forte produzione di un’altra citochina proinfiammatoria: IL-21. Inoltre gli stessi autori hanno evidenziato, nel modello in vitro della coltura d’organo intestinale di pazienti celiaci, che la neutralizzazione dell’IL-21 riduce la produzione di IFN-gamma. Pertanto anche l’IL-21 sembrerebbe essere coinvolto nel differenziamento di tipo Th1. Le Citochine Antinfiammatorie nella MC Durante la risposta immune mucosale nella celiachia, oltre alle citochine proinfiammatorie vengono prodotte anche citochine con azione antinfiammatorie principalmente IL-10 e TGF-beta. E’ ormai noto che in condizioni normali, il sistema immune, attraverso un meccanismo noto come “tolleranza orale” riconosce grandi quantità di proteine introdotte all’interno del tratto gastrointestinale con la dieta. I meccanismi alla base della tolleranza orale agli alimenti sono complessi e coinvolgono un meccanismo di soppressione mediato da cellule T regolatorie (T reg). Queste cellule regolatorie, giocano un ruolo fondamentale nell’omeostasi immunologica in quanto, in condizioni normali, la capacità di risposta immunitaria di un individuo è in equilibrio con la capacità di regolare tale risposta. Diverse sono le cellule Treg coinvolte nella tolleranza immunologica: - le cellule Tr1, in grado di sopprimere la risposta immune di tipo Th1 in vivo ed in vitro attraverso la secrezione di IL-10 e TGF-β; - le cellule Th3, che producono esclusivamente TGFβ ; - cellule Treg naturali che esprimono in modo specifico il gene Foxp3, che viene definito come un repressore trascrizionale di diversi promotori di citochine proinfiammatorie. Il fattore di trascrizione Foxp3 rappresenta un marker delle cellule Treg CD4+CD25+ ed risulta essere essenziale per la loro funzione regolatoria. IL-10 è un’importante citochina immunoregolatoria che agisce sulle cellule presentanti l’antigene, inibendo la sintesi di citochine infiammatorie e l’espressione di molecole costimolatorie e MHC di classe II, inoltre IL-10 interferisce direttamente con la proliferazione e il differenziamento delle cellule T. Il TGF-beta, l’altra principale citochina regolatoria, appartiene alla superfamiglia dei fattori di crescita, è prodotto dalle cellule emopoietiche, dai linfociti Th3 e dalle cellule Treg e nei processi infiammatori svolge un'attività chemiotattica per i monociti in un primo stadio, mentre in una fase successiva attiverebbe le stesse cellule per il rilascio di altri mediatori (es. IL-1). Il TGF-beta è anche dotato di un potenziale immunosoppressivo in quanto inibisce la proliferazione linfocitaria sia in vitro che in vivo. Gli effetti principali del TGF-beta sarebbero quelli di inibire i processi infiammatori facilitando quelli riparativi attraverso il rilascio di svariati mediatori. La Microdissezione Laser: un approccio innovativo Diversi approcci sono stati usati per studiare il pattern di citochine espresse nella celiachia ( RT-PCR,ELISA, ELISPOT, citofluorimetria, ibridizzazione in situ, etc) che spesso hanno portato a risultati contraddittori. Tuttavia, ad oggi non vi è uno studio riportante la produzione di citochine da parte delle singole popolazioni cellulari e/o dei compartimenti costituenti la mucosa intestinale dei celiaci. L’eterogeneità cellulare dei campioni di tessuto è un fattore problematico nella determinazione dei livelli di analiti in tipi cellulari specifici. La microdissezione a cattura laser (LCM) è una tecnologia rivoluzionaria, ideata da un gruppo di ricercatori diretti da Lance Liotta, Robert Bonner e Michael Emmert-Buck del National Institutes of Health (NIH), la quale consente di raccogliere sottopopolazioni omogenee di cellule intatte da sezioni solide di tessuto per l’esecuzione di analisi molecolari. Le cellule possono essere selezionate sulla base di caratteristiche morfologiche o immunoistologiche. Il microdissettore laser è uno strumento di precisione che vuole conciliare un dominio più tecnico e grossolano, quello istologico, con uno più complesso e per molti versi fragile, come quello molecolare. La stazione di LCM integra un microscopio invertito di ricerca, un laser a infrarossi(IR) a basso potenziale, uno stativo controllato con un joystick ed il meccanismo di manipolazione dotato di monitor per il controllo. Le tecniche molecolari applicate ai campioni di cellule selezionate con la LCM includono: l’amplificazione in RT-PCR, la LOH, l’instabilità dei microsatelliti, l’esecuzione del gene profiling differenziale, le microarray di cDNA, l’analisi dei prodotti proteici tramite elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilamide (2D-PAGE), ed il Western blotting. SCOPO Lo scopo del presente progetto di tesi è stato quello di indagare il pattern di citochine espresse in compartimenti diversi della mucosa intestinale di pazienti celiaci, selezionati mediante la tecnica della microdissezione laser. La microdissezione laser è stata combinata con la real time PCR per ottenere il profilo trascrizionale dei geni per le citochine analizzate, nei due compartimenti mucosali, epitelio e lamina propria. In virtù di quanto detto, lo scopo della prima parte del mio percorso di dottorato è stato quello di indagare il pattern di citochine espresse in compartimenti diversi della mucosa intestinale di pazienti celiaci, selezionati mediante la tecnica della microdissezione laser. La microdissezione laser è stata combinata con la real time PCR per ottenere il profilo trascrizionale dei geni per le citochine analizzate, nei due compartimenti mucosali, epitelio e lamina propria, cercando di far luce così sul ruolo di questi ultimi nella patogenesi della malattia. MATERIALI E METODI Sono stati reclutati, dal reparto di gastroenterologia dell’Ospedale “San G. Moscati” di Avellino, 30 pazienti; 15 di essi erano celiaci in fase attiva della malattia, mentre i restanti 15 soggetti erano rappresentati da controlli non celiaci, con presenza di lieve dispepsia. Da ciascun paziente sono stati prelevati, mediante gastroendoscopia intestinale, diversi frammenti bioptici di mucosa digiunale. I campioni bioptici congelati sono stati tagliati al criostato. Il taglio è stato effettuato a 8 μm e per ogni campione si sono ottenute 6 sezioni che sono state adagiate su un vetrino dotato di una membrana di polietilene naftalato (PEN), precedentemente incubato per 2 ore in cappa a flusso laminare sotto raggi UV per garantirne la sterilità. A questo punto si è proceduto alla fissazione, colorazione e disidratazione delle sezioni di tessuto tagliate, seguendo il seguente protocollo: • Asciugatura all’aria a temperatura ambiente per 2 minuti • Fissazione in acetone per 2 minuti a 4°C • Idratazione in tampone tris salino (TBS) per 1 minuto • Colorazione in Ematossilina Carazzi per 1 minuto. • Disidratazione. Questa fase ha previsto 3 passaggi in una serie crescente di alcoli: : Alcool 70 per 90 secondi Alcool 95 per 90 secondi Alcool 100 per 2 minuti • Asciugatura all’aria a temperatura ambiente per 5 minuti I vetrini fissati, colorati e disidratati sono stati posizionati uno alla volta sul supporto portavetrini del microdissettore (Leica DM6000, Leica Microsystem). Il taglio del compartimento epiteliale veniva preceduto dal taglio del compartimento della lamina propria. I compartimenti prima selezionati, poi tagliati, venivano raccolti, per gravità, separatamente, in due eppendorf, posizionate al di sotto del supporto porta vetrini, contenenti buffer di estrazione (30 μl) fornito dal PicoPure® RNA Isolation Kit (Life technologies, Italia) e inibitore di RNasi (1 μl). Terminata la microdissezione, le due eppendorf contenenti le cellule provenienti rispettivamente dall’epitelio e dalla lamina propria, venivano incubate in un termiciclatore a 42°C per 30 minuti, centrifugati a 16.000xg per 1-2 minuti, e conservati a -80°C fino al momento dell’estrazione dell’RNA. L’ RNA totale è stato estratto dai campioni LCM utilizzando il sistema Arcturus, PicoPure® RNA Isolation Kit (LIFE TECHNOLOGIES, ITALIA) seguendo il protocollo descritto della casa produttrice. Il protocollo di retrotrascrizione, opportunamente ottimizzato, è basato sui protocolli di Foley et al. (1993) e Leonard et al. (1993). Il cDNA è stato ottenuto dalla retrotrascrizione di 10 μl di RNA in un volume finale di 20 μl, tramite il kit VILO (Variable Input Linear Output) reverse transcriptase (LIFE TECHNOLOGIES, ITALIA) utilizzando Random Primers. I reagenti sono stati ottimizzati per ottenere il range dinamico nell’intervallo da 1 pg a 2,5 µg di RNA totale. Il cDNA è stato diluito 1:10 in TE (Tris EDTA) ed ogni campione così ottenuto è stato suddiviso in diverse aliquote in modo da evitare ripetuti stress termici. I campioni sono stati conservati a -20°C e scongelati all’occorrenza. Per l’analisi in Real Time-PCR (qPCR) si è scelta la chimica SYBR® Green, per la sua maggiore flessibilità operativa, utilizzando la Master Mix PowerSYBR Green PCR (LIFE TECHNOLOGIES, ITALIA) e come normalizzatore del segnale, il sistema ROX. La reazione di amplificazione è avvenuta in piastre da 96 pozzetti (Applied, Biosystems, Italia) ed è stata allestita in un volume finale di 35 μl, con 10 μM primer, forward e reverse trascritto specifici, e 2 μl di cDNA e l’espressione genica è stata normalizzata rispetto al trascritto della GAPDH. Una volta ottenuti i dati, si è proceduto ad effettuare l'analisi statistica degli stessi. RISULTATI L’espressione dei trascritti per il TNF-alfa e per l’IL-15 è stata quantificata, mediante qPCR, in campioni di epitelio (Ep) e di lamina propria (LP) da biopsie digiunali ottenute da 15 pazienti celiaci e 15 controlli sani. Dall’analisi dei dati è emerso che tutti i pazienti celiaci presentavano una maggiore espressione del trascritto per il TNF-alfa e per l’IL-15 rispetto ai controlli; tale aumento si riscontrava sia confrontando i compartimenti epiteliali, sia confrontando i compartimenti della LP. Inoltre, nell’ambito del gruppo dei pazienti celiaci, il trascritto per il TNF-α era significativamente aumentato (p<0,05) nel compartimento epiteliale rispetto al compartimento costituito dalla LP (Fig. 1). FIG.1 Stesso trend si riscontrava per quanto riguarda l’espressione del trascritto per l’IL-15. Infatti, tale citochina nei celiaci rispetto ai controlli, risultava significativamente aumentata sia paragonando fra di loro i due compartimenti epiteliali ( p<0,01) sia confrontando tra di loro i due compartimento della LP (p<0,01). Altresì, all’interno del gruppo dei celiaci, il trascritto per l’IL-15 risultava significativamente incrementato (p<0,01) nel compartimento epiteliale rispetto al compartimento della LP (Fig. 2). FIG.2 Anche l’espressione dei trascritti per l' IFN-gamma e per l’ IL-21 è stata quantificata, mediante qPCR, in campioni di Ep e di LP da biopsie digiunali prelevate da 15 pazienti celiaci e 15 controlli sani. In particolare il trascritto per l’IFN-γ risultava significativamente più espresso (p<0,01) a livello dell’Ep dei soggetti celiaci rispetto all’Ep dei controlli. Anche a livello della LP il trascritto era significativamente aumentato (p<0,01) nei celiaci, rispetto ai controlli (Fig. 3.3). Nel gruppo dei celiaci risultava, inoltre, un significativo aumento (p<0,01) del trascritto a livello della LP, rispetto al compartimento epiteliale (Fig. 3). FIG.3 Per quanto riguarda il trascritto per l’IL-21 dall’analisi dei dati, è emerso, che tale citochina era significativamente più espressa (p<0,01) nella LP dei pazienti celiaci rispetto alla LP dei controlli; nessuna differenza statisticamente significativa si riscontrava invece paragonando il compartimento epiteliale dei due gruppi di soggetti. Nell’ambito dei pazienti celiaci, il trascritto risultava significativamente più alto (p<0,01) a livello della LP, in confronto al compartimento epiteliale (Fig. 3.4). Nell’ambito del gruppo dei controlli, invece, si notava una maggiore espressione, statisticamente significativa (p<0,05), del trascritto per l’IL-21 a livello epiteliale rispetto alla LP (Fig. 4). FIG.4 Infine è stata quantificata l’espressione dei trascritti per il TGF-β e per l’IL-10, mediante qPCR, dall’analisi dei dati è emerso che tutti i pazienti celiaci presentavano una maggiore espressione di entrambi i trascritti rispetto ai controlli, sia confrontando i compartimenti epiteliali, sia i compartimenti della della LP. In particolare confrontando i livelli di espressione del TGF- β nel compartimento epiteliale si notava un significativo aumento (p0,05) nei livelli di trascritto paragonando i due compartimenti. Nei controlli, si notava un aumento statisticamente significativo (p<0,05) nei livelli di TGF-β a livello dell’Ep rispetto alla LP(Fig.5). FIG.5 Per quanto concerne l’IL-10, confrontando i livelli di espressione della citochina nell’Ep di entrambi i gruppi, si notava un significativo aumento (p0,05) tra i livelli di trascritto presenti nei due compartimenti mucosali, pur essendo presenti alti livelli di IL-10, rispetto ai controlli, in entrambi i compartimenti. Nel gruppo dei controlli, così come riportato per il TGF-β, anche per l’IL-10, si notava un aumento, statisticamente significativo (p