Analyse et identification d'acides aminés essentiels de l'extension C-terminale de l'ARN hélicase Dbp4

Dbp4 est une ARN hélicase de la famille DEAD-box. Elle est hautement conservée et essentielle pour la survie de la cellule puisqu'elle participe au processus de maturation de l'ARN ribosomique (ARNr) 18S. Dbp4 est formée d'un cœur catalytique conservé chez les protéines DEAD-box, d'une courte partie N-terminale et d'une extension C-terminale qui couvre ~50% de la longueur de la protéine et qui lui confère sa spécificité. Dans le cadre de ce projet, je voulais identifier, dans la partie C-terminale de Dbp4, les acides aminés clés pour son fonctionnement ainsi que les motifs fonctionnels essentiels pour son interaction avec ses partenaires et son importation nucléaire. À l'aide d'outils bio-informatiques, il a été possible d'identifier un motif coiled-coil (CC) impliqué dans les interactions protéine-protéine, des signaux de localisation nucléaire (NLS) et un domaine DUF4217 présent chez plusieurs ARN hélicases mais dont la fonction demeure inconnue. J'ai réalisé un criblage génétique et généré des mutants par mutagénèse dirigée où les motifs NLS1 et NLS2 ont été mutés et les motifs CC et DUF4217 ont été éliminés. Les premières analyses ont démontré un phénotype normal pour les mutants NLS1 et NLS2 tandis que tous les autres mutants présentent un phénotype létal. Les tests d'immunoprécipitation ont révélé que l'interaction avec la protéine nucléolaire Bfr2 est perturbée pour les mutants NLS1-2, delta-CC et delta-DUF4217, mais pas pour les autres mutants. Le ciblage génétique des mutants aléatoires en C-terminal de Dbp4 a permis d'isoler ~2% de mutants létaux dont ~61% expriment une protéine de pleine longueur incapable de complémenter la fonction de Dbp4 endogène. Dbp4 est essentielle pour la formation de la petite sous-unité du ribosome. L'identification de mutations létales nous permettra de mieux caractériser DDX10, l'homologue humain de Dbp4, et d'étudier certaines maladies qui sont liés à des mutations génétiques sur les gènes ribosomiques.\ud ______________________________________________________________________________ \ud MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : DEAD-box, ARN ribosomiques, Coiled-coil, NLS, DUF, Dbp4