Characterization and Colocalization of Tissue-Based Biomarker Expression by Quantitative Image Analysis: Development and Extraction of Novel Features

Proteins are the actual actors in the (normal or disrupted) physiological processes and immunohistochemistry (IHC) is a very efficient mean of visualizing and locating protein expression in tissue samples. By comparing pathologic and normal tissue, IHC is thus able to evidence protein expression alterations. This is the reason why IHC plays a grow- ing role to evidence tissue-based biomarkers in clinical pathology for diagnosing var- ious diseases and directing personalized therapy. Therefore, IHC biomarker evaluation significantly impacts the adequacy of the therapeutic choices for patients with serious pathologies, such as cancer. However, this evaluation may be time-consuming and dif- ficult to apply in practice due to the absence of precise positive cut-off values as well as staining (i.e. protein expression) heterogeneity intra- and inter-samples. Quantifying IHC staining patterns has thus become a crucial need in histopathology. For this task, automated image analysis has multiple advantages, such as avoiding the evidenced ef- fects of human subjectivity. The recent introduction of whole-slide scanners opened a wide range of possibilities for addressing challenging image analysis problems, includ- ing the identification of tissue-based biomarkers. Whole-slide scanners are devices that are able to image whole tissue slides at resolutions up to 0.1 micrometers per pixels, often referred to as virtual slides. In addition to quantification of IHC staining patterns, virtual slides are invaluable tools for the implementation of digital pathology work- flows. The present work aims to make several contributions towards this current digital shift in pathology. Our first contribution was to propose an automated virtual slide sharpness assessment tool. Although modern whole-slide scanner devices resolve most image standardization problems, focusing errors are still likely to be observed, requiring a sharpness assessment procedure. Our proposed tool will ensure that images provided to subsequent pathologist examination and image analysis are correctly focused. Virtual slides also enable the characterization of biomarker expression heterogeneity. Our sec- ond contribution was to propose a method to characterize the distribution of densely stained regions in the case of nuclear IHC biomarkers, with a focus on the identification of highly proliferative tumor regions by analyzing Ki67-stained tissue slides. Finally, as a third contribution, we propose an efficient mean to register virtual slides in order to characterize biomarker colocalization on adjacent tissue slides. This latter contribution opens new prospects for the analysis of more complex questions at the tissue level and for finely characterizing disease processes and/or treatment responses./Les protéines sont les véritables acteurs des processus physiologiques (normaux ou per- turbés) et l’immunohistochimie (IHC) est un moyen efficace pour visualiser et localiser leur expression au sein d’échantillons histologiques. En comparant des échantillons de tissus pathologiques et normaux, l’IHC permet de révéler des altérations dans des pro- fils d’expression protéique. C’est pourquoi l’IHC joue un rôle de plus en plus important pour mettre en évidence des biomarqueurs histologiques intervenant dans le diagnos- tic de diverses pathologies et dans le choix de thérapies personnalisées. L’évaluation de l’expression de biomarqueurs révélés par IHC a donc des répercussions importantes sur l’adéquation des choix thérapeutiques pour les patients souffrant de pathologies graves, comme le cancer. Cependant, cette évaluation peut être chronophage et difficile à appliquer en pratique, d’une part, à cause de l’hétérogénéité de l’expression protéique intra- et inter-échantillon, d’autre part, du fait de l’absence de critères de positivité bien définis. Il est donc devenu crucial de quantifier les profils d’expression de marquages IHC en histopathologie. A cette fin, l’analyse d’image automatisée possède de multiples avantages, comme celui d’éviter les effets de la subjectivité humaine, déjà démontrés par ailleurs. L’apparition récente des numériseurs de lames histologiques complètes, ou scanners de lames, a permis l’émergence d’un large éventail de possibilités pour traiter des problèmes d’analyse d’image difficiles menant à l’identification de biomar- queurs histologiques. Les scanners de lames sont des dispositifs capables de numériser des lames histologiques à une résolution pouvant atteindre 0,1 micromètre par pixel, expliquant la dénomination de "lames virtuelles" des images ainsi acquises. En plus de permettre la quantification des marquages IHC, les lames virtuelles sont des outils indis- pensables pour la mise en place d’un flux de travail numérique en pathologie. Le travail présenté ici vise à fournir plusieurs contributions au récent changement de cap vers une numérisation de la discipline médicale qu’est l’anatomie pathologique. Notre première contribution consiste en un outil permettant d’évaluer automatiquement la netteté des lames virtuelles. En effet, bien que les scanners de lames résolvent la plupart des pro- blèmes liés à la standardisation de l’acquisition, les erreurs de focus restent fréquentes, ce qui nécessite la mise en place d’une procédure de vérification de la netteté. L’outil que nous proposons assurera la netteté des images fournies à l’examen du pathologiste et à l’analyse d’image. Les lames virtuelles permettent aussi de caractériser l’hétérogénéité de l’expression de biomarqueurs. Ainsi, la deuxième contribution de ce travail repose sur une méthode permettant de caractériser la distribution de régions densément marquées par des biomarqueurs IHC nucléaires. Pour ce travail, nous nous sommes concentrés sur l’identification de régions tumorales présentant une forte activité proliférative en analysant des lames virtuelles révélant l’expression de la protéine Ki67. Finalement, la troisième contribution de ce travail fut de proposer un moyen efficace de recaler des lames virtuelles dans le but de caractériser la colocalisation de biomarqueurs IHC révé- lés sur des coupes de tissu adjacentes. Cette dernière contribution ouvre de nouvelles perspectives pour l’analyse de questions complexes au niveau histologique ainsi que la caractérisation fine de processus pathologiques et de réponses thérapeutiques.Doctorat en Sciences de l'ingénieur