Caractérisation du complexe générateur d'H2O2 DUOX/DUOXA: étude de son rôle dans la biosynthèse des hormones thyroïdiennes et dans les mécanismes de défense

Les espèces réactives de l’oxygène ont initialement été identifiées comme des produits délétères dérivés du métabolisme aérobie. Il est maintenant accepté que ces espèces sont produites de manière régulée par des enzymes et interviennent dans des fonctions cellulaires telles que la défense immunitaire, la signalisation intracellulaire, la biosynthèse des hormones et la modification de matrice extracellulaire. Les NADPH (Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate) oxydases (NOX) forment une famille d’enzymes transmembranaires capables de former de l’anion superoxyde (O2.-) par transfert d’électrons du NADPH à l’oxygène moléculaire (O2). DUOX1 et DUOX2 sont deux des sept membres composant cette famille qui génèrent directement de l’H2O2 comme produit de réduction de l’O2.Initialement clonés à partir de la thyroïde dans notre laboratoire, les ADNc codant pour les protéines DUOX ont été identifiées dans d’autres tissus, comme par exemple la prostate ou l’épithélium respiratoire où DUOX1 est majoritaire. DUOX2 se retrouve également dans les glandes salivaires, dans la muqueuse rectale et tout le long du tractus digestif. D’autre part, un orthologue de DUOX, appelé Udx1, a été identifié en 2004 au niveau de la membrane ovocytaire chez l’oursin. Dans chacun de ces tissus, l’H2O2 produit par les protéines joue un rôle clef. Le mécanisme d’activation de DUOX dans tous ces tissus n’a été identifié que récemment. En effet, pour être exprimé sous forme active à la surface cellulaire, les protéines DUOX nécessitent un facteur de maturation spécifique. Ces facteurs, appelés DUOXA1 et 2 pour « DUOX activator », suivent l’expression tissulaire de leur DUOX respectif. Nous avons montré que la région COOH-terminale de DUOXA1 est responsable de l’activité génératrice d’H2O2 de DUOX1. DUOX2 peut produire de l’H2O2 ou de l’O2.-. L’extrémité NH2-terminale de DUOXA2 est critique dans cette activité et détermine le type de dérivé oxygéné produit. Dans notre système, DUOXA2 n’est pas détecté à la surface cellulaire, sauf en cas de modification de son extrémité amino-terminale par l’addition d’un épitope. DUOXA1 peut être exprimé à la membrane plasmique mais sa présence n’est pas nécessaire au sein du complexe formé avec DUOX pour que ce dernier soit actif. Les facteurs de maturation jouent donc un rôle de protéine chaperonne, induisant la maturation et la translocation d’une protéine DUOX active à la surface cellulaire. Dans la thyroïde, l’H2O2 produit par les protéines DUOX constitue le cofacteur de la thyroperoxydase catalysant l’oxydation de l’iode et le couplage de sa forme oxydée sur des résidus tyrosines de la thyroglobuline menant in fine à la synthèse des hormones thyroïdiennes T3 et T4 et leur relarguage dans la circulation sanguine. Plusieurs mutations dans le gène DUOX2 ont déjà été décrites chez des patients atteints de dyshormonogenèse transitoire ou permanente. Nous avons mis en évidence qu’une inactivation totale de la protéine DUOX2 était compatible avec un état hypothyroïdien peu sévère et transitoire, indiquant l’intervention probable de DUOX1 dans la synthèse des hormones thyroïdiennes. Le défaut génétique identifié est composé d’une délétion génomique partielle d’un allèle associée à une mutation faux-sens (G1518S) sur l’autre allèle du patient hypothyroïdien. Cette mutation, située dans le site catalytique de l’enzyme, mène à une abolition de l’activité de l’enzyme qui est néanmoins exprimée partiellement à la surface cellulaire. Les messagers des DUOX ont été identifiés récemment dans les tractus digestif et respiratoire. Le rôle joué par l’H2O2 dans ces tissus semble avant tout être un rôle de défense contre les micro-organismes en mettant en jeu la lactoperoxydase oxydant le thiocyanate en composé bactéricide actif. Nous avons montré que l’H2O2 produit par DUOX exerce un effet répulsif sur les bactéries. En effet, l’invasion de cellules CHO exprimant de manière stable DUOX2 et DUOXA2 par Salmonella Typhimurium est diminuée lorsque la production d’H2O2 de ces cellules est stimulée. Cet effet répulsif constituerait un rôle primordial pour DUOX au niveau des muqueuses respiratoire et digestive.Lors de la fertilisation, une explosion respiratoire a lieu et de l’H2O2 est produit. Cet H2O2 fourni à l’ovoperoxydase permettrait la formation d’une enveloppe rigide autour de l’ovocyte, bloquant ainsi l’entrée de spermatozoïdes surnuméraires. Ce phénomène a été largement étudié dans l’ovocyte d’oursin, dans lequel la NADPH oxydase responsable de la production d’H2O2 a été caractérisée: il s’agit de Udx1, l’orthologue de DUOX. Chez les mammifères, le phénomène existe mais le mécanisme est en grande partie inconnu. Nous avons montré que les ARNm des DUOX sont exprimés dans l’ovocyte humain ;ceci nous permet d’émettre l’hypothèse que l’inhibition de la polyspermie chez l’homme pourrait être similaire à celle de l’oursin. Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques