Studying the role of IpaD protein in the control of Shigella flexneri virulence

Shigella est l'agent causal de la shigellose, une maladie à transmission oro-fécale, et responsable d'une grande partie des cas diarrhéiques dans les pays en voie de développement. L'infection par Shigella résulte en la colonisation et l'inflammation de la muqueuse colique. Sa virulence est liée à son Système de Sécrétion de Type 3 (SST3) qui agit comme une "seringue" moléculaire pour l'injection des protéines directement dans le cytoplasme de la cellule hôte, via un pore de translocation, provoquant la subversion de sa physiologie et l'internalisation de la bactérie. Le SST3 est composé d'un bulbe cytoplasmique, d'un corps basal et d'une aiguille extracellulaire assemblée suite à la polymérisation hélicoïdale des sous-unités MxiH, formant ainsi un canal qui permet le transit des substrats du SST3. L'extrémité de l'aiguille comprend les translocateurs IpaBCD qui constituent le complexe d’extrémité. IpaD module l'insertion membranaire des protéines hydrophobes IpaB et IpaC, qui forment le pore de translocation, et prévient, avec IpaB, la sécrétion prématurée des effecteurs avant le contact cellulaire. La sécrétion est également contrôlée à la base du SST3 par la protéine cytoplasmique MxiC qui perçoit le contact cellulaire par un signal transmis à travers l'aiguille. Ces deux dispositifs de contrôle participent à l'établissement d'une hiérarchie de sécrétion entre translocateurs, effecteurs précoces et tardifs. Lors de cette étude, nous avons essayé de mieux comprendre le fonctionnement du SST3 en ciblant la protéine IpaD. Des variants obtenus par délétions de 10 acides aminés (Schiavolin, 2013) et par mutations ponctuelles (Meghraoui, 2014) d’IpaD ont été générés pour caractériser leurs effets sur l'exposition à la surface des translocateurs, le contrôle de sécrétion, la formation du pore de translocation, et enfin l'invasion cellulaire. Nos résultats ont permis d’identifier trois phénotypes correspondant à i) une sécrétion contrôlée, similaire à la souche sauvage, ii) une sécrétion constitutive de tous les substrats, et iii) un phénotype de sécrétion intermédiaire. Les variants par délétions nous ont permis de comprendre l'importance de la localisation d'IpaD et IpaB à la surface pour le fonctionnement du SST3. Les variants par mutations ont révélé l'indépendance entre le contrôle de sécrétion et l’invasion cellulaire, ainsi qu’une corrélation entre la sécrétion prématurée des translocateurs/effecteurs précoces et l'augmentation de la virulence in vitro. Nous avons aussi étudié les partenaires d'interaction d'IpaD (Meghraoui, in prep) et MxiC (Cherradi, 2013) respectivement à l'extrémité de l'aiguille et à la base du SST3. L'interaction d'IpaD avec elle-même et avec MxiH a pu être montrée uniquement après délétion du domaine auto-chaperon d’IpaD. Ce domaine semble essentiel au maintien d'IpaB à l'extrémité de l'aiguille, au contrôle de sécrétion, à l'insertion du translocon, mais pas à l'invasion cellulaire. D'autre part, nous avons démontré que l'interaction entre MxiC et le composant de la tige interne MxiI participe au contrôle interne de la sécrétion. En conclusion, nos travaux contribuent à une meilleure compréhension du lien entre différents composants et fonctions du SST3 et de l'implication d'IpaD dans la régulation allostérique de la sécrétion. Ces résultats dépassent le cadre de Shigella puisque les composants étudiés dans le cadre de cette thèse sont conservés chez d’autres bactéries utilisant le SST3 comme dispositif principal de virulence./Shigella is the causative agent of shigellosis, an oro-fecally transmitted disease, among major causes of diarrhoea in developing countries. Infection by Shigella results in the colonisation and inflammation of colonic mucosa. The virulence of this bacterium is related to a Type 3 Secretion System (T3SS) that acts as a molecular syringe to inject proteins directly into host cell cytoplasm, through a translocation pore, leading to subversion of cell physiology and bacterial internalisation. The T3S apparatus (T3SA) is composed of a cytoplasmic bulb, a basal body and an extracellular needle. The needle is assembled through the helical polymerisation of MxiH subunits that form a channel allowing the passage of T3S substrates and topped by the translocators IpaBCD (needle tip complex). IpaD is a hydrophilic protein that modulates the membrane insertion of the hydrophobic IpaB and IpaC (translocation pore) and prevents, along with IpaB, the leakage of proteins before cell contact. Secretion is also controlled at the base of the T3SA by cytoplasmic MxiC that senses cell contact through the transmission of a signal along the needle. These two control devices are involved in the establishment of a secretion hierarchy between translocators, early and late effectors.In this study, we aimed to better understand the function of the T3SS by targeting the tip protein IpaD. Ten amino-acid deletion (Schiavolin, 2013) and point mutation (Meghraoui, 2014) variants of IpaD were generated to characterise their effects on translocators exposure, secretion control, pore formation and cell invasion. Three secretion phenotypes were identified and correspond to wild-type like secretion control, constitutive secretion and an intermediate secretion phenotype. Deletion variants allowed us to understand the requirement of IpaB and IpaD surface exposure for the T3SS functions. Mutation variants highlighted the uncoupling between secretion control and cell entry and the correlation between the premature secretion of translocators/early effectors and the enhanced in vitro virulence. We also studied interaction partners of IpaD (Meghraoui, in prep) and MxiC (Cherradi, 2013) at the needle tip and T3SA base, respectively. The bindings of IpaD to itself and to the needle subunit MxiH were only possible after deletion of the self-chaperoning domain. This domain was essential for the correct maintenance of IpaB at the needle tip, the secretion control, the insertion of the translocon, but not for cell entry. Besides, we showed that the interaction of MxiC with inner rod component MxiI participates in the internal control of secretion. In conclusion, these observations facilitated our understanding of the links between the different components and functions of the T3SS and the involvement of IpaD in the allosteric regulation of secretion. Our work is relevant beyond the Shigella field as genes studied here are conserved among several pathogenic bacteria using T3SS as a virulence weapon. Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques