Characterisation of selected neuropeptide systems in the marine model organism Platynereis dumerilii

Neuropeptide stellen eine wichtige Klasse aus Signalmolekülen dar, die im Gehirn hergestellt werden und wichtige Funktionen in Physiologie, Entwicklung und im Verhalten steuern. Etliche Neuropeptidfamilien sind schon früh in der Evolution von Tieren entstanden und lassen sich sowohl bei Protostomen als auch bei Deuterostomen (inklusive Wirbeltiere) finden, weswegen sie vermutlich relevant für fundamentale Prozesse sind. In meiner Arbeit wurden zwei dieser Neuropeptidfamilien untersucht: die GnRH-ähnliche und die Oxytocin/Vasopressin (OT/AVP) Familie. Beide Familien spielen eine wichtige Rolle in der Fortpflanzung von Wirbeltieren, wobei ihre ursprüngliche Funktion noch unklar ist (Gruber, 2014)(Roch et al., 2014a). In Platynereis dumerilii findet man noch beide Peptidhormonfamilien (Tessmar-Raible et al., 2007; unpublished). Wie in vielen anderen marinen Arten findet man auch bei dieser Spezies einen streng regulierten Reproduktionszyklus, welcher mit den Mondphasen korreliert und unter der Kontrolle der molekularen circa-lunaren Uhr steht (Zantke et al., 2013). Die zeitliche Abstimmung der Fortpflanzung ist außerdem von anderen schwer messbaren metabolischen und hormonellen Faktoren abhängig. Mithilfe von qPCR konnte ich nachweisen, dass diese ausgewählten Neuropeptid-Vorläufermoleküle eine Rolle in der Reproduktion von Platynereis spielen, da ihre Transkriptionslevel während der Reifung signifikant erhöht sind. In meiner Arbeit konzentrierte ich mich auch auf die Charakterisierung des OT/AVP Signalsystems, indem ich versuchte die Role von Vasotocin, das Peptidkorrelat in Platynereis, zu entschlüsseln. Ich konnte die Bindung von VTN an zwei orthologe Rezeptoren, nämlich VtnR1 und VtnR2 nachweisen und somit bestätigen, dass der VTN Ligand zu dieser orthologen Gruppe von Peptiden gehört. Die Transkriptionslevel der Vtn und VtnR Gene, welche im Kopf nachweisbar höher waren als im Rest des Körpers, waren zwar zu niedrig um ihre Lokalisierung durch In-Situ-Hybridisierung zu ermitteln, aber mithilfe von anti-VTN Antikörpern konnte ich die aktiven VTN Neuropeptide im ventralen Bereich des Gehirnes von erwachsenen Tieren nachweisen. Im Rahmen dieses Projektes, habe ich zur Etablierung des ersten Werkzeuges für Gen-Knockouts in Platynereis beigetragen, indem TALEN-Konstrukte für das OT/AVP-ähnliche Gen Vasotocin-Neurophysin (Vtn) hergestellt wurden(Bannister et al., 2014). Diese Entdeckungen lassen schließen, dass Pdu-Vasotocin eine neuromodulatorische Funktion hat und möglicherweise eine Rolle im reproduktiven Verhalten spielt. Diese Hypothese kann nun mithilfe homozygoter Tiere aus der von mir hergestellten Mutantenlinie verifiziert werden.“ Den neuesten phylogenetischen Studien zufolge sind die GnRH-ähnlichen Peptide und ihre Rezeptoren Teil einer größeren AKH/CRZ/ACP/GnRH Superfamilie, die gleichen evolutionären Ursprungs sind, welcher bis zur Aufteilung der Proto- und Deuterostomia zurückgeht. In den Protostomia wurden diese Genfamilien aufgespalten, wobei jede Gruppe ihre Subfunktion erhielt. Im zweiten Teil meiner Arbeit, habe ich diese Hypothese in Platynereis in unterschiedlichen Ansätzen getestet. Ich habe dabei gezeigt, dass im Transkriptom des Platynereis vier orthologe Peptide kodiert werden, die den AKH- und CRZ/invGnRH-Untergruppen zugeordnet werden können, obwohl evolutionsbiologische Schlüsse auf solche kurze Sequenzen schwer zu ziehen sind. Phylogenetische Analysen des G-Protein gekoppelten Rezeptors (GPCRs) zeigten, dass Platynereis zwei Arten von AKHR-Typ Rezeptoren und einen CRZ/invGnRHR-TypRezeptor besitzt. Diese phylogenetische Bestimmung wurde unabhängig in einem Zell-basierten Validierungsassay von anderen Studenten und Kollaborateuren bestätigt. Die Entdeckung, dass invGnRHR3 an beide Rezeptoren bindet, deutet auf eine Interaktion dieser Faktoren hin und zeigt, dass dieses System viel komplexer ist als gedacht. Durch In-Situ-Hybridisierungen konnte ich die Platynereis crz/gnrh1, akh1 und akh2 Vorläufermoleküle in verschiedenen Bereichen des Gehirns in Platynereis lokalisieren. Dies deutet darauf hin, dass die Peptide zwar unterschiedliche Funktionen haben, aber dennoch die gleichen Zellen ansprechen. Um die Rolle der invGnRHs näher bestimmen zu können, testete ich die Funktion des Platynereis crz/gnrh1 Gens im Mutantenstamm. Meine Analysen zeigten, dassrein homozygote Weibchen sich während ihrer Reifezeit im Vergleich zum WT und Männchen signifikant früher vermehren. Männchen zeigten keinen Unterschied zum WT. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass invGnRHs eine Rolle in der Stoffwechselumstellung und in der Reifung spielen und somit auch die zeitliche Abstimmung der Fortpflanzung beeinflussen. Der Phenotyp kann dabei noch immer durch andere Liganden, welche an den selben Rezeptor binden, kompensiert und damit können andere Funktionen durch den Knock-out des Pdu-GnRHR3 Rezeptorgens demaskiert warden.Neuropeptides are an important class of signaling molecules produced by the nervous system to regulate diverse body functions such as physiology, development and behavior. Several neuropeptide families, which have originated early in animal evolution, are shared between protostomes and deuterostomes (including vertebrates) and may hence have relevance for fundamental processes. In my thesis, I investigate two of these ancient families of neuropeptides: the Oxytocin/Vasopressin (OT/AVP) family and the GnRH-like family. Both families have relevance for vertebrate reproduction, however their ancient function is difficult to conclude given their challenging evolutionary history (Gruber, 2014) (Roch et al., 2014a). The marine annelid Platynereis dumerilii, consistent with its slow evolutionary pace, has retained both OT/AVP-like and invGnRH-like peptide hormones (Tessmar-Raible et al., 2007 ; unpublished). Like many other marine species, it has a tightly regulated reproductive cycle, which is timed according to the lunar phase and is under the control of a molecular circa-lunar clock (Zantke et al., 2013). Moreover, the reproductive timing is dependent on other metabolic factors and hormonal cues, which still remain elusive. Through qPCR, I was able to confirm that these selected neuropeptide precursors are involved in its reproductive biology, since their transcripts are significantly upregulated during maturation. The first part of my thesis will focus on the characterisation of the ancient OT/AVP signaling system, by trying to decipher the role of Vasotocin, the single peptide correlate in Platynereis. Initially, I was able to validate the binding of VTN to 2 ortholog receptors, named Pdu-VtnR1 and VtnR2, confirming VTN ligand belongs to this orthologous group of peptides. Transcripts levels of vtn and vtnr genes, which were found to be more abundant in heads than elsewhere in the body, were too low to be localized through whole mount in-situ hybridization. Nevertheless, with the help of anti-VTN antibodies, I succeeded in detecting the active VTN neuropeptide in the ventral brain area of adult worms. Importantly, as part of my project, I also contributed to the establishment of the first molecular gene knockout tool in Platynereis by creating functional TALENs constructs for the OT/AVP-like gene vasotocin-neurophysin (vtn) (Bannister et al., 2014). The mutant strains I generated will now be relevant for uncovering the function of Vtn in Platynereis According to the most recent phylogenetic studies, GnRH-like peptides and their receptors are part of a wider AKH/CRZ/ACP/GnRH superfamily having a common evolutionary origin, which dates back to the split of Proto- and Deuterostomia (Hauser and Grimmelikhuijzen, 2014). In Protostomia these families have then diverged and subfunctionalised. As a second part of my study, I investigated this hypothesis in Platynereis using different approaches. First, I showed that Platynereis transcriptome encodes 4 peptide precursors that cluster into the AKH and the CRZ/invGnRH subgroups. However, evolutionary conclusions on such short sequences are difficult to determine. Phylogenetic analyses on candidate G-protein coupled receptors (GPCRs) for these ligands revealed that Platynereis possesses 2 AKHR-type and 1 CRZ/invGnRHR-type receptor candidates. This phylogenetic assignment was independently confirmed by a cell-based validation assay, performed by another student and collaborators. More interestingly, the discovery that Platynereis invGnRHR3 binds to both CRZ/invGnRH-type and AKH-type ligands suggests rather a crosstalk and adds complexity to the system. Through whole mount in situ hybridization I localized Platynereis crz/gnrh1, akh1 and akh2 precursors to different domains of the worm’s brain, indicating peptides might have distinct roles, but still signal to the same receptive cells. Finally, to shed more light onto the enigmatic role of invGnRHs, I analysed a Platynereis crz/gnrh1 mutant strain. My analyses revealed that homozygous females, when tested for their maturation timing, spawned significantly earlier compared to wild-type females and males, which showed no difference. These results are compatible with a role of invGnRHs in energy-switch processes and/or maturation, therefore affecting reproductive timing, though the phenotype might still be compensated by the other ligands acting on the same receptor and other functions could be unmasked by knocking out Platynereis invGnRHR3 receptor gene