Investigating immunomodulatory properties of the transferrin receptor (CD71) in human T cells

Der Transferrin Rezeptor (TfR, CD71) ist ein omnipräsenter Oberflächen-rezeptor jeder proliferierenden Zelle, der essentiell für den menschlichen Eisen-metabolismus ist. Bindung von eisengesättigtem Transferrin (Tf) an dem TfR führt zur Internalisierung des Tf/TfR Komplexes mittels Clathrin – abhängiger Endozytose und zur Freisetzung von Eisen innerhalb der Zelle. Obwohl die zellbiologische Rolle von CD71 im Eisenstoffwechsel hinreichend untersucht ist, ist wenig über dessen immunmodulatorischen Funktion in primären, humanen T-Zellen bekannt. In dieser Arbeit wurden vier monoklonale Maus anti-human CD71 Antikörper (mAk) VIP-1, 15-221, 13-344 und 5-528, die drei unterschiedliche Epitope erkennen, eingesetzt. Diese mAks wurden in löslicher Form zu der Stimulierung von primären und peripheren T-Zellen via Platten gebundenen anti CD3/CD28 mAks beigefügt. Von diesen vier mAks reduzierten zwei (VIP-1, 15-221) die Tf Bindung und Internalisierung durch Ak-vermittelter Rezeptorverminderung, und inhibierten darüber hinaus das Wachstum der T-Zellen, aber nicht deren Zytokinsekretion. Wurden diese T-Zellen in Abwesenheit von VIP-1 und 15-221 restimuliert, waren sie immer noch deutlich in ihrer Proliferation supprimiert – ein Zustand, der auch mit Zugabe von exogenem IL-2 nicht aufgehoben werde konnte, obwohl CD71 an der Zelloberfläche quantitativ wieder vollständig hergestellt war. Eine nachhaltige Wachstumshemmung trotz präsentem CD71 konnte ebenso in der Jurkat T-Zelllinie nachgewiesen werden. Weiters war die für die T-Zellaktivierung wichtige NFAT/AP-1/ NF-κB Induzierung in der Zellllinie durch VIP-1 und 15-221 nicht unterdrückt, was auf intakte T-Zell Signalwege hindeutet. Eine Proteomanalyse von VIP-1 behandelten Jurkat Zellen zeigte als mögliche Ursache der Wachstumsinhibierung das Fehlen von für den Zellzyklus wichtigen Transportproteinen wie Rab-5c, Rab-9a und Rab-11b auf. Des Weiteren wurde die Funktion von Serum IgA, einem zuletzt neu entdeckten Liganden von TfR, untersucht. Platten gebundenes Serum IgA verursachte eine dosisabhängige Wachstumssteigerung und erhöhte die Zytokinausschüttung in CD63 kostimulierten primären T-Zellen. Weiters steigerte die Vorbehandlung mit löslichem Serum IgA die Zytotoxizität von T-Zellen gegenüber THP-1 Zellen. Dieser Effekt konnte mit VIP-1 neutralisiert werden. Zusammenfassend kann berichtet werden, dass die in vitro eingesetzten mAks VIP-1 und 15-221, die gegen zwei unterschiedliche humane TfR Epitope gerichtet sind, die Tf Aufnahme reduzieren und zu der nachhaltigen Hemmung des T-Zell Wachstums führen, bei der die Zytokinausschüttung jedoch nicht unterbunden ist.The transferrin receptor (TfR, CD71) is an abundant surface receptor expressed on all proliferating cells and is fundamental for the human iron metabolism. Engagement of iron-loaded transferrin (Tf) and TfR leads to clathrin-mediated endocytosis of the receptor-ligand complex and release of iron within the cell. Regardless of its central position in cell biology, little is known about the function of CD71 in primary human T cells. In this work, four murine anti-human monoclonal antibodies (mAbs) VIP-1, 15-221, 13-344 and 5-528 that recognize three different epitopes of CD71, were added soluble to human, peripheral blood T cells activated via plate-bound CD3/CD28 mAbs. Among these four mAbs, two (VIP-1, 15-221) reduce Tf binding as well as inter-nalization due to Ab-mediated downmodulation and, moreover, inhibit T cell proliferation. Regardless of the observed negative impact on proliferation, T cells treated with CD71 mAbs maintained their capacity to secrete cytokines like IL-2, IFN-γ or IL-10. Further, despite the restored CD71 expression, induction of an unresponsive state in T cells is detectable upon restimulation in absence of VIP-1 and 15-221 and was not reversible by adding exogenous IL-2. Similary, Jurkat T cells also showed a sustained growth deprivation though equivalent CD71 expression. Moreover, crucial NFAT/AP-1/NF-κB signaling needed for T cell activation was not suppressed by VIP-1 and 15-221 in a multi-channel reporter Jurkat T cell line. Concerning proliferation deficiency, proteome analysis of VIP-1 treated Jurkat cells points to an aberrant cell cycle progression due to the absence of necessary trafficking proteins such as Rab-5c, Rab-9a and Rab-11b. In addition to the mAbs, the function of serum IgA, which is a less known natural ligand of CD71, was investigated. Plate-bound serum IgA promoted a dose-dependent proliferative effect that occured with elevated cytokine levels in CD63 co-stimulated primary T cells. Furthermore, pretreatement with soluble serum IgA increased cytotoxicity of T cells against THP-1 cells, an effect that was neutralized with VIP-1. In summary, targeting of two distinct human TfR epitopes in vitro that reduces Tf uptake, but does not alter cytokine secretion, induces sustainable inhibition of T cell proliferation