Wirkung verschiedener Biomaterialien auf Osteoblasten in vitro

Knochenschäden infolge von traumatischen Verletzungen, Tumorresektionen oder operativen Rekonstruktionen erfordern die Anwendung von Knochenersatzmaterialien. Gegenwärtig verfügbare Transplantate, wie die Verwendung von autologen oder allogenen Knochenmaterialen, und Allotransplantaten mit demineralisierter Matrix oder osteogenen Proteinen sind nur limitiert verfügbar. Das Forschungsgebiet der Knochenregenerationsmedizin hat sich aufgrund dieser Notwendigkeit rasch weiterentwickelt und die Entwicklung von Biomaterialien als Knochenersatz stellt dabei einen wichtigen Forschungsbereich dar. Ziel dieser Diplomarbeit war die Untersuchung von Effekten potentieller Biomaterialen für den Bereich „bone tissue engeneering“. Getestet wurden zwei verschiedene Klassen von abbaubaren Biomaterialien. Einerseits wurden Einflüsse von Gelatine und andererseits von einem synthetischen Copolymer auf den Differenzierungsprozess und der Mineralisationsfähigkeit von Osteoblasten untersucht. Zur Beurteilung dieser Materialien wurden Parameter wie Zellviabilität und knochenspezifische Marker (Alkalische Phosphatase Aktivität und Matrixmineralisation) herangezogen. Weder das Verfahren zur Gewinnung der Gelatine, noch Unterschiede in physikochemische Parameter wie isoelektrischer Punkt oder Gelierfähigkeit hatten einen Einfluss auf die Alkalische Phosphatase Aktivität MC3T3-E1 Zellen über den getesteten Zeitraum. Aktive Alkalische Phosphatase konnte in sämtlichen Gruppen mittels Färbemethode detektiert werden. Die Fähigkeit extrazelluläre Matrix zu mineralisieren wurde jedoch bei allen Gelatinegruppen gefördert. Physikochemische Parameter und Gewinnungsmethode der Gelatine bewirkten deutliche Unterschiede in der Matrixmineralisation. Sämtliche Beschichtungen, die als Einzelkomponente Gelatine Typ B enthielten oder in einer Mischung mit Gelatine Typ B gefertigt wurden, führten im Vergleich zu den anderen Gelatinebeschichtungen zu einer höheren Matrixmineralisation. Bei Gegenüberstellung beider Ausgangsmaterialien als Scaffoldmaterial hinsichtlich ihres Effektes auf Zellviabilität und –proliferation, Osteoblastendifferenzierung und Mineralisation extrazellulärer Matrix, zeigte sich in sämtlichen Experimenten, dass LCM6 einen deutlich stärkeren Einfluss auf zelluläre Prozesse ausübt als LCM3. Primären Maus-Osteoblasten konnten auf dem Materialtyp LCM3 adhärieren, proliferieren, differenzieren und schließlich synthetisierte Matrix mineralisieren. In den in vitro Experimenten resultierte für diese Gruppe, trotz verminderter Anzahl an metabolisch aktiven Zellen, eine positive Färbung für das Enzym Alkalische Phosphatase und für die Matrixmineralisation. Im Gegensatz dazu kam es beim Biomaterial LCM6 neben der starken Reduktion in Proliferation und Viabilität zu einer Hemmung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase und zu einem nur sehr geringen Anstieg an mineralisierter Matrix über 21 Tage. Die Materialzusammensetzung, vor allem das Verhältnis der Einzelkomponenten zueinander (Lactid, Caprolacton und Methacrylat) und die damit verbundenen Eigenschaften, nehmen laut den erhaltenen Ergebnissen Einfluss auf Proliferation, den Differenzierungsprozess und auf die Matrixmineralisationsfähigkeit. Im Falle des Biomaterial LCM6 erwiesen sich eine Erhöhung des Lactid-Anteils und ein verringerter Prozentsatz an Methacrylat als nicht günstig für die getesteten Zellfunktionsparameter.Bone loss causing from trauma, surgical tumor removal or reconstructive surgeries requires the usage of bone graft substitutes. Current treatments as autologous or allogenic bone grafts, allografts with demineralized matrix or osteogenic proteins are limited available. Therefore the design of biomaterials with osteogenic, osteoinductive and osteoconductive properties become more and more interesting. In the present diploma thesis work, the effect of potential biomaterials for bone grafting was tested on osteoblast proliferation and differentiation. Two polymers were investigated. One polymer was the macromolecule gelatin and the other one was a synthetic copolymer (LCM) Mouse calvarial derived osteoblasts or MC3T3-E1 cells were cultured on various gelatine coatings or on different photopolymerized LCM discs. Cells were directed to osteoblast lineage by growing them in differentiation media containing ascorbic acid (50µg/ml) and β-glycerophosphate (5mM). To determine effects on osteoblast proliferation, differentiation and mineralization, assays were performed for cell viability and proliferation (MTS-assay), alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralized matrix was visualised with alizarin red. Independent from the extraction method or gel strength of the tested gelatin coatings, osteoblasts attached on the pre-coated surfaces and showed ALP activity in all groups. There was no significant difference observed between the different investigated gelatin types according to ALP activity. But mineralized matrix production was enhanced in the presence of gelatin compared to the control on tissue culture plastic. Osteoblast attachment and proliferation was also observed by culturing cells on different synthetic polymer-compositions (LCM3 and LCM6). Even if a reduction in the metabolic activity of osteoblasts on LCM3 and LCM6 was monitored, LCM3, but not LCM6, supported alkaline phosphatase expression and matrix mineralization. In conclusion, both biomaterials showed supporting effects on osteoblast differentiation in vitro. In the process of bone healing, both, osteoblast and osteoclast play a major role. Therefore further experiments have to be established to determine effects on osteoclast development as well as to determine the potency of these materials for in vivo bone formation