NAD+ analogues as colorigenic and fluorogenic chemical probes for NAD+ consuming enzymes

NAD+ konsumierende Enzyme spielen eine wichtige Rolle in fundamentalen zellulären Prozessen und es wurde gezeigt, dass sie an verschiedenen Krankheiten und der Verlängerung der Lebensspanne beteiligt sind. Um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen und potenzielle Enzymaktivatoren oder –inhibitoren zu finden, hat sich der Ansatz der chemischen Untersuchungsmoleküle (chemical probes) bei manchen Enzymen als erfolgreich herausgestellt. Ein wichtiges Ziel besteht noch immer darin, deren Anwendbarkeit zu erweitern und neue Untersuchungsmoleküle zu entdecken. In diesem Projekt wurden zwei künstliche Analoga von Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+), nämlich Adenosindiphosphat-Ribosyl-para-Nitrophenol (ADPRpNP) und Adenosindiphosphat-Ribosyl-Umbelliferon (ADPRumb), synthetisiert, charakterisiert und auf ihre Eignung als chemische Untersuchungsmoleküle getestet. Nach erfolgreicher Herstellung der Verbindungen über jeweils Ein-Topf-Synthesen und mehrere Reinigungsschritte wurden geeignete Wellenlängen für Absorptionstests (bei ADPRpNP) und Fluoreszenztests (bei ADPRumb) bestimmt. Die Verbindungen wurden auf Erkennung von Adenosindiphosphat-Ribosyl (ADPR) Zyklase von Aplysia californica und NAD Glykohydrolase aus Schweinehirn untersucht. Keines der Moleküle wurde von ADPR Zyklase in einem kontinuierlichen Testsystem umgesetzt und es konnte keine Spaltung von ADPRpNP durch NAD Glykohydrolase in einem diskoniuierlichen System bemerkt werden. ADPRumb zeigte geringe Umsetzung (2 %) durch NAD Glykohydrolase unter den Testbedingungen (0.012 U/mL, pH 8.0, 37 °C, 4 h), was die Nutzung dieser Verbindung als chemisches Untersuchungsmolekül für NAD Glykohydrolase limitiert. Keine der getesteten Verbindungen zeigte signifikantes Potenzial, als chemisches Untersuchungsmolekül für ADPR Zyklase oder NAD Glykohydrolase zu dienen.NAD+ consuming enzymes play an important role in fundamental cellular processes and have been shown to be involved in various diseases and the extension of lifespan. To understand underlying mechanisms and to find potential enzyme activators or inhibitors, the approach of chemical probes has proven to be successful on some enzymes, but broadening the applicability and discovering new probes is still an important goal. In this project, two non-natural analogues of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), namely adenosine diphosphate ribose para-nitrophenol (ADPRpNP) and adenosine diphosphate ribose umbelliferone (ADPRumb), were synthesised, characterised and tested for their suitability as chemical probes. More precisely, after the successful acquisition of the compounds through one-pot syntheses followed by several purification steps, suitable wavelengths for absorbance assays (for ADPRpNP) and fluorescence assays (for ADPRumb) were determined. The compounds were tested for recognition by adenosine diphosphate ribose (ADPR) cylcase of Aplysia californica and NAD glycohydrolase from porcine brain. Neither of the molecules was turned over by ADPR cylcase in a continuous assay and no cleavage from ADPRpNP could be detected when incubated with NAD glycohydrolase in a discontinuous assay. ADPRumb showed low conversion (2 %) by NAD glycohydrolase under the tested conditions (0.012 U/mL, pH 8.0, 37 °C, 4 h), limiting its usage as a chemical probe for NAD glycohydrolase. Neither of the tested compounds showed significant potential to serve as a chemical probe for ADPR cyclase or NAD glycohydrolase