Dissection of Rho-kinase Signaling Using Biophysical and Cell Biological Tools

Das Aktin-Zytoskelett ist entscheidend für viele zelluläre Prozesse und wird kontrolliert durch kleine GTPasen der Rho Familie. Ein bekanntes Mitglied ist RhoA, welches so grundlegende Prozesse wie Zellmigration und Zellkontraktion reguliert. RhoA kontrolliert das Aktin-Zytoskelett durch verschiedene Effektoren, wobei die Rho assoziierte Kinase (ROCK) besonders bedeutend ist, weil sie sowohl direkt als auch indirekt auf Aktomyosin wirken kann. Während die Wichtigkeit der ROCK Substrate bekannt ist und ihre Folgen auf das Aktin-Zytoskelett gut beschrieben sind, weiß man nur wenig über die Regulation der katalytischen Aktivität von ROCK. Zusätzlich zur Funktion als RhoA-Effektor, kann ROCK auch an Membranen und an Gerüstproteine binden. Die gegenwärtige Auffassung ist, dass die ROCK Kinasedomäne von den regulatorischen, lipid- und RhoA-bindenden Domänen inhibiert wird. Allerdings sind die genauen molekularen Einzelheiten dieses Autoinhibitonsmechanismus´ unbekannt. Diese Masterarbeit untersucht drei verschiedene Faktoren (oligomerer Zustand, Membranbindung und RhoA-Interaktion), die entscheidend für die ROCK-Signaltransduktion sind und versucht - mit Hilfe von komplementären biophysikalischen und zellbiologischen Ansätzen - aufzugliedern - in welchem Umfang diese zur Regulation von ROCK beitragen. Durch die Anwendung einer neuen Methode, die Fluoreszenz-Größenaußschluss-chromatographie (FSEC) mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) verknüpft, konnte die Größe/Konformation und der oligomere Zustand von nativem ROCK2 untersucht werden. Die Daten legen den Schluss nahe, dass ROCK2 ein sehr ausgedehntes und ausschließlich dimeres Protein ist. Signalmoleküle des PI3K-Signalwegs oder Arachidonsäure führen nicht zur Membrantranslokation von ROCK2, obwohl frühere Berichte die Vermutung zuließen, dass sie spezifische Lipidliganden von ROCK sein könnten. Rekombinantes RhoA wurde gereinigt und eine Methode etabliert, die es ermöglicht das RhoA gebundene Nukleotid zu bestimmen. Dies ist eine grundlegende Voraussetzung für weitere Experimente um die RhoA-ROCK Bindung zu charakterisieren. An Hand dieser Erkenntnisse und anderen experimentellen Ergebnissen der Forschungsgruppe, kann ein Strukturmodell für ROCK abgeleitet werden. Dieses Modell trifft die Vorhersage, dass die intrinsische ROCK Kinaseaktivität nicht durch Autoinhibition reguliert wird. Diese Ergebnisse bedingen eine Revidierung des Wirkmechanismus durch den ROCK essentielle zelluläre Prozesse kontrolliert. Wir schlagen vor, dass die Aktivität von ROCK durch die zelluläre Lokalisierung von ROCK und seiner Substrate reguliert ist.The actin cytoskeleton is crucial for many cellular processes and is tightly controlled by small GTPases of the Rho family. A prominent member is RhoA which regulates such fundamental processes as cell migration and contraction. RhoA exerts its control on the actin cytoskeleton via different effectors with Rho-associated kinase (ROCK) being particularly important because of its direct and indirect effect on actomyosin. While the importance of ROCK substrates is known and their effect on the actin cytoskeleton is well described, the question of how ROCK activity is regulated is just poorly understood. In addition to being a downstream RhoA effector, ROCK can also bind to membranes and scaffolding proteins. The current view is that the kinase domain of ROCK is maintained in an inhibited state by the membrane and RhoA binding domains. However, the precise molecular details of this autoinhibitory mechanism are unknown. This thesis addresses three different factors (oligomeric state, membrane binding and RhoA interaction) that are crucial for ROCK signaling and attempts to dissect to what extent they contribute to ROCK regulation by applying complementary biophysical and cell biological approaches. This thesis reports a novel characterization method coupling fluorescence size exclusion chromatography (FSEC) with fluorescence correlation spectroscopy (FCS) to investigate the size/conformation and oligomeric state of native ROCK2 in mammalian cells. The obtained data suggest that ROCK2 is a constitutive, highly extended and exclusively dimeric species in mammalian cells. In vivo, ROCK2 does not translocate in response to PI(3,4,5)P3 or arachidonic acid although both had been previously suggested to be specific membrane ligands for ROCK2. Finally, the recombinant RhoA was purified and a method was established to determine its nucleotide state. This is an essential prerequisite for further in vitro experiments to characterize the RhoA ROCK interaction. On the basis of these findings and other experimental data from our group a structural model for ROCK in mammalian cells can be derived. Our model predicts that intrinsic ROCK kinase activity is not regulated by an autoinhibitory mechanism. As such our data demand a revision of the working mechanism by which ROCK controls essential cellular processes. We propose that ROCK is simply regulated by the discrete subcellular localization of itself and its substrates