Studies of meiotic recombination in the ciliate Tetrahymena thermophila

Die Meiose, eine spezielle Zellteilung, reduziert den diploiden Chromosomensatz somatischer Zellen und ermöglicht dadurch die sexuelle Reproduktion von Eukaryoten. Spezifische zelluläre und molekulare Vorgänge, die charakteristisch für die meiotische Teilung sind, führen zu genetisch unterschiedlichen, haploiden Gameten. Homologe Rekombination, ein reziproker DNA-Austausch zwischen elterlichen Chromosomen, ist ein entscheidender Prozess während der Meiose und eine Quelle für genetische Diversität. Sie beginnt mit der Enstehung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) und der Reparatur dieser Brüche am homologen Chromosom. Dies führt zum Austausch von DNA und zur Bildung von Crossovers (COs). Für eine fehlerfreie Chromosomenaufteilung muss die Reparatur aller DSBs korrekt erfolgen. Fehler in diesem Prozess können die Ursache von Sterilität, Totgeburten oder chromosomal aberranten Nachkommen sein. Die Meiose ist ein biologisch und evolutionär grundlegender Prozess und wurde in zahlreichen Modellorganismen, im speziellen S. cerevisiae, S. pombe, C. elegans, Drosophila, Arabidopsis und der Maus studiert. Im Zuge dieser Arbeit untersuchte ich die meiotische Rekombination im phylogenetisch weit entfernten Protisten Tetrahymena thermophila, der während der Meiose keinen Synaptonemalen Komplex (SC), eine Meiose-spezifische Paarungsstruktur, aufbaut. Ich studierte die Funktion und evolutionäre Konservierung der Rekombinationsproteine Mre11, Sae2/Com1, Sgs1 und Mus81 im Kontext der ungewöhnlichen Meiose dieses Ciliaten. Mre11 und Sae2/Com1 sind für die erste Stufe der meiotischen Rekombination, der Aufbereitung gebrochener DNA-Enden für die Reparatur, verantwortlich. In S. cerevisiae und C. elegans hat Mre11 eine zusätzliche Funktion in der Erzeugung meiotischer DSBs. Deletion von Mre11 oder Sae2/Com1 führt zu Sterilität in Tetrahymena. Ich adaptierte eine Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE) basierende Methode zur Detektion von DSBs in synchron induzierten Meiosen von Tetrahymena Massenkulturen. Kombiniert mit zytologischen Analysen zeigte dieser biochemische Ansatz, dass das Fehlen von lebensfähigen Nachkommen in der Abwesenheit von Mre11 oder Sae2/Com1 durch einen Defekt in der DSB-Verarbeitung und Reparatur, nicht jedoch in der Entstehung von DSBs verursacht wird. Damit gehört Tetrahymena, gemeinsam mit S. pombe und Pflanzen, in eine Gruppe von Eukaryonten, die Mre11-unabhängige meiotische DSBs bildet. Weiters lassen meine Untersuchungen den Schluss zu, dass, anders als für S. cerevisiae und S. pombe Meiose beschrieben, Mre11 and Sae2/Com1 unabhängig voneinander funktionieren. Die Ähnlichkeit zwischen Tetrahymena und C. elegans in dieser Hinsicht wird in der Diskussion dieser Dissertation angesprochen. Sgs1 und Mus81 sind in späteren Schritten der rekombinatorischen DSB-Reparatur beteiligt. Die Nuklease Mus81 löst Zwischenprodukte der Rekombination auf und ist dadurch an der meiotischen CO-Bildung beteiligt. Der Beitrag von Mus81 bei der Bildung von COs ist in den verschiedenen Modellorganismen unterschiedlich, da weitere Faktoren, wie z.B. der Mlh1-Mlh3 Komplex, die Rekombinationsintermediate auflösen können. Mus81 erzeugt einen Teil der COs in S. cerevisiae und C. elegans. In der Maus hängt nur ein geringer Anteil der COs von Mus81 ab, während in S. pombe COs überwiegend, wenn nicht ausschließlich, von Mus81 erzeugt werden. Die Sgs1 Helicase hingegen besitzt eine gut charakterisierte Anti-CO-Aktivität, die zur Auflösung von Rekombinationszwischenprodukten und dabei zur Bildung von Noncrossover-Produkten (NCO) führt. In der hier vorgelegten Dissertation untersuchte ich die Auswirkung des Fehlens von Mus81 und Sgs1 auf die Meiose von Tetrahymena. In situ Beobachtungen zeigten, dass Chromosomen während der Meiose nicht aufgeteilt werden können, wenn Mus81 oder Sgs1 inaktiviert sind. Weiteres belegte die Analyse der Meiosen dieser Mutanten mittels PFGE die Akkumulation von unaufgelösten Rekombinationszwischenprodukten. Diese Beobachtungen erlauben den Schluss, dass in Tetrahymena beide Proteine, Mus81 und Sgs1, benötigt werden, um Rekombinationsintermediate zu prozessieren. Weiteres konnte ich einen möglichen Beitrag des Mlh1-Mlh3 Komplexes zur Auflösung von meiotischen Rekombinationszwischenprodukten ausschließen und dadurch zeigen, dass Tetrahymena, ähnlich wie S. pombe hauptsächlich (wenn nicht ausschließlich) die Nuklease Mus81 zur Erzeugung von COs verwendet. Folglich entwickelten diese beide entfernt verwandten Organismen, welche jeweils den SC verloren, ähnliche Methoden der meiotischen Rekombination. Allerdings ist, anders als bei den üblichen Modellsystemen, Sgs1 für die Meiose von Tetrahymena essenziell. Schliesslich wird der wahrscheinliche Beitrag dieses Proteins zur Bildung von NCO in einem Modell des Rekombinationsmechanismus in Tetrahymena diskutiert.Meiosis is a special type of cell division, essential for the sexual reproduction of eukaryotic species. It is characterized by a distinct set of cellular and molecular events that lead to the formation of genetically variant haploid gametes. A critical step of meiosis is the process of reciprocal DNA exchange between parental chromosomes as a source of genetic diversity. It starts from the induction of programmed DNA double-strand breaks (DSBs) whose repair via homologous recombination leads to DNA exchange and crossover (CO) formation. All the repair steps have to be accurately fulfilled in order to ensure proper chromosome segregation. If not accomplished, it can cause sterility, stillbirth or chromosome abnormalities. Meiosis as an evolutionarily and biologically fundamental process has been studied in several model organisms, in particular S. cerevisiae, S. pombe, C. elegans, Drosophila, Arabidopsis and mouse. In the work presented here, I studied meiotic recombination in the phylogenetically distant protist Tetrahymena thermophila, which does not feature a synaptonemal complex (SC), the specialized meiotic pairing structure. I investigated the function and evolutionary conservation of recombination proteins such as Mre11, Sae2/Com1, Sgs1 and Mus81 in the context of this ciliate´s unusual meiosis. Mre11 and Sae2/Com1 proteins are crucial for the first step of meiotic recombination, which is the preparation of broken DNA ends for repair. In S. cerevisiae and C. elegans, Mre11 has an additional function in DSB generation. In Tetrahymena, Mre11 or Sae2/Com1 deletion causes sterility Taking advantage of the ability of Tetrahymena to undergo synchronous meiosis in mass cultures, I adapted a pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)-based method for DSB detection. Combined biochemical and cytological analysis showed that the lack of viable progeny is accounted for by a defect in DSB processing and repair in the absence of Mre11 or Sae2/Com1, but not a failure in the induction of DSBs in Mre11 depleted cells. The dispensability of Mre11 for meiotic break formation puts Tetrahymena together with S. pombe and plants to the group of eukaryotes that share the feature of Mre11-independent DSB formation. On the other hand, the obtained results suggest that the required cooperativity of Mre11 and Sea2/Com1 in DSB processing, described in S. cerevisiae and S. pombe meiosis, might be not the case in Tetrahymena. Tetrahymena may share this feature with C. elegans, which will be addressed in the discussion in this PhD thesis. Sgs1 and Mus81 are involved in later steps of DSB recombinational repair. The Mus81 nuclease resolves recombination intermediates and it is implicated in meiotic CO formation. However, since there exist other resolving factors, such as the Mlh1-Mlh3 complex, the contribution of Mus81 resolvase to CO generation differs among investigated organisms. In S. cerevisiae and C. elegans, Mus81 generates a subset of COs, in mouse and Arabidopsis, only a minor CO fraction depends on Mus81, whereas CO formation in S. pombe, predominantly, if not exclusively, depends on Mus81. The Sgs1 helicase on the other hand, possesses a well-characterized anti-CO activity, which leads to the disassembly of recombination intermediates and noncrossover (NCO) products formation. In this PhD study, I investigated the depletion phenotypes of Mus81 and Sgs1 in Tetrahymena meiosis. In situ observations revealed that in the absence of Mus81 or Sgs1, chromosomes fail to separate during meiotic divisions. The PFGE analysis of these mutants showed the accumulation of unresolved recombination intermediates. Thus, both Mus81 and Sgs1 are required for the processing of recombination intermediates in Tetrahymena. Moreover, I excluded a possible participation of the Mlh1-Mlh3 complex as a resolving factor. Therefore, Tetrahymena relies on the predominant (if not only) use of the Mus81 nuclease similar to S. pombe, with whom it also shares the lack of an SC. Therefore, these two unrelated eukaryotes, which both lost their SC during evolution, evolved similar ways of executing meiotic recombination. On the other hand, Tetrahymena is the first organism where Sgs1 is dispensable for meiosis, and its probable engagement in NCO formation is presented in a model of the meiotic recombination pathway in Tetrahymena