Das Zytoskelett des menschlichen Ventrikelmyokards und dessen Veränderungen aufgrund von Herzversagen

Die Herzfunktion wird durch präzise regulierte Interaktionen zwischen Proteinen des Muskelzytoskeletts und den essentiellen kontraktilen Proteinen gewährleistet. Kardiomyopathien führen zu fortschreitendem Herzversagen und stellen die häufigste Erkrankung dar, die eine Herztransplantation notwendig macht. Mittlerweile ist bekannt, dass durch Mutationen verursachte Störungen dieser präzise regulierten Protein-Protein Interaktionen des Muskelzytoskeletts zu einer veränderten Proteinzusammensetzung führen, was in Folge zur Entwicklung von Kardiomyopathien beiträgt. Ziel dieser Diplomarbeit war es die subzelluläre Organisation verschiedener Proteine der Kardiomyozyten, die durch Studien an Tiermodellen als mögliche frühe Marker für Kardiomyopathien vorgeschlagen worden waren, in versagenden menschlichen Herzen im Vergleich zu Kontrollproben zu charakterisieren. Dazu wurden spezifische Antikörper gegen diese Proteine zur Immunfluoreszenzfärbung von Kryo- und Paraffinschnitten mit darauffolgender Analyse durch konfokale Mikroskopie verwendet. Gleichzeitig wurde auch die Morphologie der Proben auf subzellulärer Ebene untersucht. Die Ergebnisse der konfokalen Mikroskopie bestimmten die weitere Richtung der Analyse mit Immunoblots. Die Resultate deuten darauf hin, dass die Veränderungen in der Komposition und Struktur der Interkalierten Scheiben, die bei der MLP (muscle LIM protein) Knockoutmaus (einem Mausmodell für die dilatative Kardiomyopathie, DCM) zu sehen waren, nur in einigen vererbbaren DCM Proben nachgewiesen werden können. Sowohl lichtmikroskopisch als auch an den Immunoblots war dabei eine Hochregulierung des N-RAP (nebulin-related anchoring protein) und des Adherens Junctions Proteins β-Catenin sowie eine Herrunterregulierung des Gap Junction Proteins Connexin-43 zu erkennen. In den meisten anderen Proben mit DCM im Endstadium zeigte sich jedoch ein heterogenes Bild. Für die vergleichende Analyse sind dabei natürlich die heterogene genetische Herkunft, das weit variierende Alter, sowie eine unterschiedliche Medikamentation erschwerend. Trotzdem war auffallend, dass die Kontrollen bei der Analyse der Expression von Proteinen der Interkalierten Scheiben eine relativ geringe Variabilität untereinander aufwiesen. Die erneute Expression des humanen EH-(embryonales Herz)-Myomesin, welches als Marker für eine DCM vorgeschlagen wurde, konnte in den meisten versagenden humanen Herzproben nachgewiesen werden. Nachdem das Protein am stärksten bei einer Arrhythmogenen Rechtsventrikulären Dysplasie hochreguliert war erscheint es allerdings als spezifischer Marker für DCM ungeeignet. In dieser Arbeit wurde auch erstmals die subzelluläre Verteilung des N-RAP, eines aktinbindenden Proteins der Interkalierten Scheibe, im humanen Ventrikelmyokard beschrieben. Das N-RAP war, entgegen der bisher an Mäusen beschriebenen Lokalisierung, im humanen Ventrikelmyokard nicht nur an den Interkalierten Scheiben sondern auch unterschiedlich stark an den Z-Scheiben der Myozyten, bevorzugt in der Peripherie aber auch in der Nähe des Zellkerns zu finden. Nachdem die präzise Funktion von MLP und auch dessen Rolle in Herzerkrankungen bei Tiermodellen und Mensch ungeklärt ist, wurden Immunoblot Analysen der Proteinmengen von MLP in Proben von Patienten mit Herzversagen im Endstadium durchgeführt. Die Expressionslevel von MLP im LV der Patienten mit Herzversagen im Endstadium mit einer durchschnittlichen linksventrikulären Auswurffraktion (LVEf) von 15% waren gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht. Daraus lässt sich ableiten, dass eine Hochregulierung nicht ausschließlich auf eine Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) zutrifft, sondern dass ein Anstieg der Expression mit verminderter LVEf korreliert ist. Auch wenn in dieser Arbeit kein universal gültiger Marker für eine DCM gefunden werden konnte, kann die Immunfluoreszenzfärbung mit hochspezifischen Antikörpern Einblicke in die auf subzellulärer Ebene stattfindenden Veränderungen gewährleisten. Jene gehen weit über die Information der histologischen Standardfärbungen hinaus und können für den beobachteten Phänotyp durchaus erklärend sein.The functional integrity of the heart is maintained by precise interactions between proteins of the muscle cytoskeleton and essential contractile proteins. Cardiomyopathies lead to progressive heart failure and are the most common reason for heart transplantations. Today it is well known that mutations can cause disturbances between these precisely regulated protein-protein interactions, which lead to a modified composition of the muscle cytoskeleton and results in the development of cardiomyopathies. The goal of this diploma thesis was to analyze in failing human hearts the subcellular organization of different proteins of cardiomyocytes, which had previously been shown to be altered in animal models of cardiomyopathies and had been suggested as potential early markers. Samples from human patients with different cardiomyopathies were compared with healthy human heart tissue. Specific antibodies against different cytoskeletal proteins were used for immunofluorescence labeling of paraffin- and cryosections, which were then analyzed using confocal microscopy. Additionally the morphology of the samples was investigated at the subcellular level. The results of these investigations determined the further direction of immunoblot analysis. The results indicate that the altered composition and structure of the intercalated discs that had been described in the MLP (muscle LIM protein) knockout-mouse (a mouse model for dilated cardiomyopathy, DCM), could only be demonstrated in a few inheritable DCM samples. There, light microscopy and immunoblot analysis revealed an upregulation of N-RAP (nebulin-related anchoring protein) and of the adherens junction protein ß-catenin, as well as a downregulation of the gap junction protein connexin-43. However, most other DCM samples showed a more heterogeneous picture. The comparative analysis was made more complicated by the heterogeneous genetic origin, varying ages, as well as different medication of the patients. Nevertheless it is interesting, that the protein expression levels of the intercalated discs in healthy control samples showed relatively low variation. The renewed expression of human EH-(embryonic heart)-myomesin, which had been suggested as a marker for DCM, could be demonstrated in most of the human failing heart samples. However, since the protein showed the highest upregulation in the case of arrhythmogenic right ventricular dysplasia, it cannot be used as a specific marker for DCM. This diploma thesis also characterized for the first time the subcellular distribution of N-RAP, an actin-associated protein from the intercalated disc in the human ventricular myocardium. N-RAP could be found not only at the intercalated disc, but also, with varying amounts, in the Z-discs of the myocytes, mainly in the periphery as well as close to the nucleus. This localization is different to N-RAP’s localization in mouse hearts. Since the exact function of MLP as well as its role in heart disease is still unknown, immunoblot analyses of MLP levels were conducted in samples from patients with heart failure in final stages. The MLP expression levels were significantly higher in the left ventricle of patients with an average left ventricular ejection fraction (LVEf) of 15% in comparison to controls. This suggests that an upregulation of MLP does not only occur in hypertrophic cardiomyopathy (HCM), but also indicates a correlation with decreased LVEf. Even though this diploma thesis did not yield a universal marker for DCM, immunofluorescence labeling with highly specific antibodies can give insights into alterations at a subcellular level. This technique goes far beyond the information level of standard histological stains and can provide useful data for the explanation of the examined phenotype