Electron tomography of actin networks in plastic embedded tissue culture cells

Konventionelle Fixierung und Plastikeinbettung von Zellen für die Elektronenmikroskopie führt zur Zerstörung von Actin Netzwerken migrierender Zellen. Das sowie die limitierte Penetrationstiefe in der Transmissionselektronenmikroskopie haben die Analyse des Actin Zytoskeletts auf die dünnen peripheren Lamellipodien von Zellen in Monoschichtkulturen beschränkt, welche zusätzlich mit Detergenzien extrahiert werden müssen um das Zytoskelett frei zu legen. Daraus resultierend fehlen uns Strukturinformationen von Zellen die sich in einer 3d Matrix bewegen, über die räumlichen Interaktionen von Actin Filamenten mit der Plasmamembran sowie, über die strukturelle Organisation von zentralen Zellbereichen. Aus diesem Grund habe ich eine neue Methode zur Herstellung von in Plastik eingebetteten Schnittpräparaten entwickelt. Hierbei wurden Zellen in Monoschichtkulturen zunächst mit einer niedrigen Triton X-100 Konzentration extrahiert und nach Hochdruckgefrieren in einem Aceton basierendem Medium, welches Tanninsäure und Glutaraldehyd enthielt, gefriersubstituiert. Dies ermöglichte eine simultane Erhaltung der Membran und des Actin Zytoskeletts für elektronen-tomographische Untersuchungen.Conventional fixation and plastic embedding of tissue culture cells for electron microscopy leads to destruction of actin filament networks of migrating cells. This situation, together with limitations set by the penetration depth in transmission electron microscopy, has restricted analysis of actin network architecture to the thin peripheral lamellipodia of whole cells in monolayer culture that have been extracted with detergent to expose the cytoskeleton. As a result, we lack structural information on cells moving in 3d matrices as well as on the spatial relationship of actin filaments with the plasma membrane and structural organization of central cell compartments. To this end, I developed a new plastic sectioning approach, in which monolayer tissue culture cells were extracted with a low Triton X-100 concentration prior to high-pressure freezing followed by freeze-substitution in an acetone based freeze-substitution medium containing tannic acid and glutaraldehyde. This approach enabled simultaneous structural preservation of membranous compartments together with the actin cytoskeleton for electron tomography investigations