Characterization of a novel inhibitor of fatty acid synthase in malignant, immortalized and normal ovarian surface epithelial cells

Das Ovarialkarzinom gilt mit ungefähr 140.000 weltweiten Todesfällen im Jahr 2008 als die schwerwiegendste gynäkologische Erkrankung. Wegen fehlender Screening-Möglichkeiten und dem späten Auftreten von Symptomen werden viele Patientinnen erst diagnostiziert, wenn sich die Krankheit bereits in einem fortgeschrittenen Stadium befindet. Die Standardtherapie umfasst die chirurgische Entfernung der Eierstöcke und von Teilen der Eileiter (Salpingo-Oophorektomie), sowie auf Platin/Taxanen basierende Chemotherapien. Unglücklicherweise folgt auf eine initiale Regression häufig rezidives Wachstum des Tumors bei gleichzeitigem Auftreten einer Resistenz gegenüber Chemotherapeutika. Neue Erkenntnisse über die Ätiologie von Eierstockkrebs erlauben eine bessere Vorhersage der Wirksamkeit bestimmter therapeutischer Ansätze, wie zum Beispiel moderner Antikörper-basierender oder niedermolekularer Behandlungen. Obwohl zielgerichtete Therapien in klinischen Studien bereits einen Anstieg des progressionsfreien Überlebens erbracht haben, konnte damit im Bereich der Gesamtüberlebensrate von Ovarialkarzinom-Patientinnen noch kein deutlicher Fortschritt erzielt werden. Es herrscht daher dringender Bedarf an neuen Behandlungsmöglichkeiten, die auf bestimmte Charakteristika maligner Zellen abgestimmt sind. Die Reprogrammierung metabolischer Eigenschaften ist ein typisches Merkmal von Tumorzellen. Bestimmte Veränderungen im Metabolismus maligner Zellen wurden bereits 1920 von Otto Warburg entdeckt, als er feststellte, dass Krebszellen eine gesteigerte aerobe Glykolyse aufweisen (der Warburg Effekt). Moderne analytische und genetische Werkzeuge haben zur Entdeckung zahlreicher weiterer Merkmale im Metabolismus maligner Zellen verholfen. Das führte in den letzten Jahren zu einem gesteigerten Interesse an der Erforschung von Tumortherapien, die auf metabolische Eigenschaften zielen. Eine dieser metabolischen Besonderheiten von Krebszellen (u.a. auch Ovarialkrebszellen), die gesteigerte Syntheserate von Fettsäuren, ist Gegenstand dieser Arbeit. Fettsäure-Synthase (engl.: fatty acid synthase) (FASN) ist das Schlüsselenzym in der Synthese von langkettigen, gesättigten Fettsäuren (vor allem Palmitinsäure) und ist in Tumoren häufig überexprimiert. Präklinische Studien beschreiben die Effektivität in der Reduktion von Tumorzellwachstum einiger niedermolekularer Inhibitoren der FASN. Dieses Projekt bedient sich der gut beschriebenen, FASN-inhibierenden Wirksubstanz C75, sowie des neuen niedermolekularen FASN-Inhibitors G28UCM. Damit sollten die Effekte der Blockade der Fettsäuresynthese auf maligne, immortalisierte und normale ovariale Oberflächenepithelzellen (OSE) studiert und verglichen werden. Dabei hat G28UCM gegenüber C75 den Vorteil, dass dieser Wirkstoff keine unspezifische Bindung an das Enzym Carnitin-Palmityltransferase (CPT1) – welches an der Oxidation von Fettsäuren beteiligt ist – aufweist. Die bekannte Modulation von CPT1 durch C75 wird in vivo mit schweren Nebenwirkungen in Verbindung gebracht. Mittels Wachstumsassays, Western Blot und Durchflusszytometrie konnte festgestellt werden, dass beide FASN-Inhibitoren das Wachstum von malignen, aber auch immortalisierten und normalen Oberflächenepithelzellen des Ovars reduzieren. Als dafür verantwortliche zelluläre Prozesse konnten Apoptose, Autophagie, Proteindegradation (nur bei C75) und Zellzyklusarretierung identifiziert werden. Damit einhergehend wurde für beide Inhibitoren eine Beeinträchtigung intrazellulärer Signaltransduktionskaskaden – allen voran des Phosphatidylinositol-3 Kinase/Akt Signaltransduktionsweges – nachgewiesen, die für einen Teil der beobachteten zytozidalen Effekte verantwortlich sein könnten. Exogene Bereitstellung von Oleinsäure konnte die von beiden FASN-Inhibitoren hervorgerufene Reduktion der Zellproliferation zumindest partiell aufheben. Dadurch wurde die Wichtigkeit von Lipiden für den Metabolismus von Tumorzellen, sowie die Spezifizität beider Inhibitoren hervorgehoben. Interessanterweise konnte nach Behandlung mit C75, bzw. G28UCM eine äußerst divergente Expression des Hitzeschockproteins (engl.: heat-shock protein) HSP70 gezeigt werden. Behandlung mit C75 führte im Gegensatz zu einer Behandlung mit G28UCM zu einem beträchtlichen Anstieg der Proteinmenge von HSP70. Im Hinblick auf die (protektive) Rolle dieses Proteins bei der Verarbeitung zellulären Stresses, könnte dies erklären warum G28UCM das Zellwachstum effektiver reduziert. Diese Eigenschaft könnte auch bei der Entwicklung neuer Fettsäure-Synthase-Inhibitoren wichtig sein. Zudem weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass G28UCM im Gegensatz zu C75 keine Ubiquitinierung von Proteinen verursacht und (speziell in nicht-malignen Zellen) der weniger zytotoxische Wirkstoff ist.Ovarian cancer is the most fatal gynecological disease with about 140.000 deaths worldwide in the year 2008. Many patients are diagnosed at an advanced stage, due to missing screening options and late appearance of symptoms. Standard therapeutic interventions include surgery (salpingo-oophorectomy) and platinum/taxane based chemotherapy. Unfortunately, after a period of regression, relapse of tumor growth and chemo-resistance are a common phenomenon. Recent progressions in the understanding of ovarian cancer etiology allow for better predictions of the efficacy of a certain therapeutic approach, including modern antibody- or small molecule- based treatments. Although clinical trials using targeted therapies were able to document increases in progression-free survival, overall survival rates remain poor. Therefore, novel approaches targeting certain characteristics of malignant cells are urgently needed. Metabolic reprogramming is a distinctive feature of tumor cells. Certain alterations in the metabolism of malignant cells were already recognized in the 1920s by Otto Warburg, who found that cancer cells show a high rate of aerobic glycolysis (the Warburg effect). With the availability of modern analytical and genomic tools, more and more characteristics of malignant metabolic reprogramming were discovered. In recent years, there is increasing scientific interest in the research of metabolic targets for cancer therapy. One potentially targetable and thus druggable feature of many cancers, including ovarian cancer – which is in the focus of this study - is the increased rate of de novo synthesis of fatty acids. Fatty acid synthase (FASN), the key enzyme responsible for the production of long-chain saturated fatty acids (predominantly palmitic acid) was found to be frequently upregulated in tumors. Several small molecule inhibitors of FASN have shown efficacy in reducing tumor cell growth in preclinical trials. In this project, C75 – a well characterized inhibitor of FASN – as well as the novel compound G28UCM have been used to study and compare the effects of blockade of fatty acid synthesis on malignant, immortalized and non-malignant ovarian surface epithelial (OSE) cells. A major advantage of G28UCM is that, unlike C75, it does not modulate the protein carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) which is involved in the oxidation of fatty acids and causes severe side effects in vivo. Using cell growth assays, Western blot technique and flow cytometry, we could prove that both inhibitors of FASN are able to reduce cell growth of malignant, but also of immortalized and of non-malignant OSE cells via induction of apoptosis, autophagy, protein degradation (only C75) and cell cycle arrest, respectively. Concomitantly, both FASN-inhibitors elicited a decrease in cellular signaling – predominantly through the phosphoinositide-3 kinase/Akt pathway – which may be responsible for some of the observed cytocidal effects. Decreased cellular proliferation established by either C75 or G28UCM could be – at least partially – restored by the addition of exogenous oleic acid, highlighting the importance of lipids in cancer cell metabolism and the specificity of the inhibitory drugs. Interestingly, we observed a very divergent expression pattern for heat-shock protein 70 (HSP70) after treatment with C75 and G28UCM, respectively. While C75-treated cells experienced a remarkable increase in expression of HSP70, no such effect was obtained with G28UCM. Given the (protective) role of HSP70 in cellular stress response, this may explain the better efficacy of G28UCM in reducing cell growth and may be important in the development of new FASN-inhibiting agents. A major improvement of G28UCM over C75 is that it does not induce protein ubiquitination and causes less cytotoxicity, especially in non-malignant cells