Austestung von Biomaterialien auf Osteoklasten

Synthetische Knochentransplantate haben großen Nutzen zur Behebung von Knochenschäden bei kritischer Größe, wie sie durch Frakturen, Krankheiten wie Knochentumoren und Infektionen oder kongenitale Zustände entstehen können. Gelatine stellt als denaturierte und daher weniger allergene Form von Kollagen, dem organischen Hauptbestandteil des Knochens, eine Alternative zu biologischem Material dar. Tricalciumphosphat kann in Biomaterialien den anorganischen Anteil des Knochens nachahmen, weswegen eine Kombination aus Gelatine und Tricalciumphosphat ein ideales Biomaterial darstellt. Um ein Kompositmaterial aus verschiedenen Gelatinetypen und Tricalciumphosphat herzustellen, musste Gelatine mit Glutardialdehyd kovalent quervernetzt werden. Nach Beschichtung von Deckgläsern mit den gewünschten Gelatine- oder und Pektinlösungen, bzw. Gelatine-Tricalciumphosphat-Suspensionen, wurden diese Materialien an Osteoklasten untersucht. Der Einfluss dieser Biomaterialen auf die Osteoklastenanzahl wurde mittels TRAP-Färbung und anschließender Zellzählung der TRAP-positiven Osteoklasten unter dem Lichtmikroskop bestimmt. Zur Beurteilung des Zytoskeletts und der Kernmorphologie wurde eine Aktin-/DAPI-Färbung durchgeführt. Desweiteren wurde eine Fluoreszenzmarkierung mit Integrin β3-Antikörper durchgeführt, um auch die Lokalisation des Adhäsionsproteins Integrin β3 unter Einfluss verschiedener Beschichtungen zu untersuchen. Alle Gelatinetypen führten zu einer Reduktion der Osteoklastenanzahl, wobei Gelatine Typ B alleine und in Kombination mit anderen Gelatinetypen die Osteoklastenbildung in allen durchgeführten Experimenten vollständig hemmte. Bei Zusatz von Tricalciumphosphat zu Gelatine Typ B kam es nur noch zu Verringerung der Osteoklastenzahl, aber nicht zu vollständiger Reduktion. Gelatine p.a. und Pektin zeigten den geringsten inhibitorischen Effekt, Gelatine Typ A 300 g/90 - 110 g Bloom schienen eine Art „Synergismus“ bezüglich Hemmung der Osteklastenbildung zu haben, da es in dieser Gruppe zu einer stärkeren Hemmung kam, als in Gruppen unter Verwendung der Reinsubstanzen. Generell waren bei Tricalciumphosphat-Zusatz die entstandenen Osteoklasten kleiner als ohne Tricalciumphosphat und auch die Zellzahl war geringer. Die verschiedenen Gelatinetypen hatten dabei kaum Einfluss auf die Zellzahl, wobei Gelatine Typ B die höchste Osteoklastenzahl aller Gelatine-Tricalciumphosphat-Beschichtungen aufwies. Bei der Aktin-/DAPI-Färbung zeigten Osteoklasten auf Beschichtung mit Gelatine Typ A, 90 – 110 g Bloom den höchsten Anteil an Aktinringen, während sich alle anderen Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe eher indifferent verhielten. Besonders im Falle der Beschichtung mit Gelatine Typ A, 300 g Bloom waren oft mehrere Aktinringe pro Osteoklast vorhanden, das Aktingerüst jedoch weniger intensiv gefärbt. Beschichtungen mit Gelatine p.a. und Pektin führten zur Bildung großer Osteoklasten mit entsprechend vielen Zellkernen, Mischungen aus beiden Substanzen hatten jedoch wenig Effekt auf die Zellmorphologie. Bezüglich der Lokalisation von Integrin β3 konnte in den untersuchten Gruppen (Gelatine Typ A 90 – 110 g Bloom, Gelatine p.a., Gelatine p.a./Pektin) im Vergleich zur Kontrollgruppe kein Unterschied festgestellt werden.Synthetic bone grafts have lots of benefits in the remedy of critical size defects that can be the result of fractures and diseases such as bone tumors, infections and congenital conditions. Gelatin as the denatured and therefore less allergenic form of collagen, the main organic part of bone, is a good alternative to biological material. In biomaterials, tricalciumphosphate can mimic the inorganic part of bone, which is why a combination of gelatin and tricalciumphosphate leads to an ideal biomaterial. To produce a composite material of different gelatin-types and tricalciumphosphate, gelatin had to be covalently cross linked with glutardialdehyde. After the coating of coverglasses with the desired gelatin- or pectin-solutions and gelatin-tricalciumphosphate-suspensions respectively, a mouse-coculture-system was performed to produce osteoclasts. To assess the influence of these produced biomaterials on osteoclast-numbers, TRAP-staining and afterwards counting of the TRAP-positive cells with an optical microscope was performed. Cytoskeleton and morphology of the nuclei was examined by actin-/DAPI-staining and evaluation with fluorescence microscopy. In addition to actin-/DAPI-staining immunofluorescence with an integrin β3 antibody was performed to assess the localization of the adhesion protein integrin β3 and if it was affected by the different coatings. All gelatin-types resulted in a reduction of osteoclast-numbers. Gelatin type B alone and in combination with other gelatin-types lead to complete inhibition of osteoclast formation. However, adding tricalciumphosphate to gelatin type B only resulted in a reduction of osteoclast numbers, instead of complete inhibition. Gelatin p.a. and pectin showed the lowest inhibitory effect, while gelatin type A 300 g/90 – 110 g bloom appeared to have a synergistic effect regarding osteoclast formation as the reduction of osteoclast numbers was higher than in coatings that only consisted of one of the substances. When tricalciumphosphate was added to the gelatin-coatings, the formed osteoclasts were smaller compared to coatings without tricalciumphosphate and the cell numbers were lower. Different gelatin-types hardly had any effect on cell numbers in this case, but gelatin type B showed the highest osteoclast number of all gelatin-tricalciumphosphate-coatings. In actin-/DAPI-staining, osteoclasts on coatings with gelatin type A, 90 – 110 g bloom showed the highest percentage of actin rings. All other groups reacted indifferently compared to the control group. Especially in case of coatings with gelatin type A, 300 g bloom, several actin rings per osteoclast where visible, however the actin was stained less intense. Gelatin p.a.- and pectin-coatings resulted in the formation of big osteoclasts with a high number of nuclei, mixtures of both substances however had little effect on cell morphology. With regard to the localization of integrin β3 no difference in the examined groups (gelatin type A, 90 – 110 g bloom, gelatin p.a., gelatin p.a./pectin) to the control group was detected