Ubiquitin- and Proteasome-dependent protein turnover in Arabidopsis thaliana

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein kleines Molekül, welches in allen höheren Organismen die eine Rolle als Signalmolekül spielt. Es ist bereits bekannt, dass NO in Pflanzen nicht nur die Antwort auf Umweltstress, sondern auch Entwicklungsprozesse reguliert. Einige Mechanismen, wie die S-Nitrosylierung von regulatorischen Proteinen in Pflanzen, wurden bereits beschrieben, viele molekulare Mechanismen sind aber immer noch rätselhaft. Hier wurde gezeigt, dass NO Proteine mit N-terminalem Cystein in den Ubiquitin-abhängigen Proteinabbaubbau einschleust und dass dieser Prozess O2 erfordert. Diese Experimente deuten darauf hin, dass der durch NO eingeleitete Abbau von Proteinen eine Rolle bei der NO-vermittelten Signaltransduktion spielt. Die Expression einer Ubiquitin-Variante mit Arg anstelle von Lys in Position 48 (ubK48R) führt in der Arabidopsis Linie RV86-5 zum Zelltod. Um diesen Zelltodprozess zu verstehen, muss ubK48R Expression in RV86-5 frei von Effekten sein, die auf das Expressionssystem zurückzuführen sind. Da vom verwendeten Aktivierungssystem unerwünschte Effekte berichtet worden waren, wurde versucht, herauszufinden, ob solche Effekte die Zelltodprozesse in RV96-5 Pflanzen beeinflussen. Die Ergebnisse lieferten Informationen über die funktionelle Relevanz des Systems. Ein weiterer Teil der Diplomarbeit knüpfte an das Thema Zelltod an mit der Untersuchung von Suppressormutanten, welche die Expression von ubK48R überleben. 5 Mutantenlinien waren zuvor durch EMS-Mutagenese erzeugt worden, sud2 (SUPPRESSOR OF UBIQUITIN UBK48R-INDUCED CELL DEATH 2) war die interessanteste dieser Mutanten. Die Mutation war auf Chromosom 3 kartiert worden, aber weitere Experimente waren notwendig, um nach der partiellen Genomsequenzierung Mutationen in der relevanten Region des Genoms zu bestätigen. Basierend auf einer neuen Validierungsmethode (Sedlazeck et al. 2013) wurden Kandidatenmutationen mit der Sanger-Sequenzierungsmethode bestätigt. Diese Bemühungen führten zu potentiellen Kandidaten für das SUD2 Gen.Nitric Oxide (NO) is a small molecule present in all higher organisms that plays a role as a significant signaling compound. It is already known that plants use NO as a regulatory compound not only in response to the stress coming from the environment, but also in developmental processes. Although some mechanisms in plants have been reported, such as S-nitrosylation of regulatory proteins, many molecular mechanisms are still an enigma. Here we show that NO targets protein substrates with N-terminal Cysteine for ubiquitin-dependent degradation and that this process requires O2. These experiments suggest that NO-mediated protein turnover plays a role in plant NO sensing and signaling. Expression of a ubiquitin variant with Arg instead of Lys at position 48 (ubK48R) in the Arabidopsis plant line RV86-5 leads to cell death. In order to understand the downstream effects of this process in a precise manner, ubK48R expression in line RV86-5 has to be devoid of any side effects due to the expression system. Since the GVG activation system, which is present in line RV86-5, has already been reported as having side effects, we tried to find out whether it has any effect on cell death in RV86-5. These results provided reliable information about the functional relevance of the system. Another part of the Thesis is related to the previous topic; analyzing a suppressor mutant that survives the lethal effects of ubK48R. 5 mutant lines had previously been generated by EMS mutagenesis and sud2 (SUPPRESSOR OF UBIQUITIN UBK48R-INDUCED CELL DEATH 2) was the most promising among them. The position of SUD2 had been mapped to chromosome 3, but there were still experiments necessary for validation after next generation sequencing of the relevant region. Based on scoring developed by Sedlazeck et al. (2013), we tried to validate candidate mutations using Sanger sequencing methods for confirmation. These efforts provided us with potential candidate(s) for the SUD2 gene