Cell fate regulation in the Arabidopsis thaliana stem

Organe multizellulärer Organismen sind komplexe Strukturen, die sich in einem außerordentlichen Maß aus unterschiedlichen Zelltypen mit verschiedensten Funktionen zusammensetzen können. Diese verschiedenen Zelltypen entstammen wenigen pluripotenten Stammzellen, die in bestimmten Entwicklungsstadien oder Positionen innerhalb des Orgamismus aktiv sind. In Pflanzen bleiben diese Stammzellpopulationen, auch Meristeme genannt, auch im adulten Organismus erhalten und ermöglichen diesem dadurch ein theoretisch unbegrenztes Wachstum. Apikalmeristeme an Spross- und Wurzelspitze sind verantwortlich für das longitudinale Wachstum des Pflanzenkörpers, während in den meisten Gymnospermen und Dikotyledonen das Kambium, ein laterales Meristem, zusätzliches Dickenwachstum ermöglicht. Das Kambium ist in einer zylindrischen Domäne an der Peripherie der Sprossachse lokalisiert. Es besteht aus meristematischen Zellen, die durch perikline Teilungen nach außen gerichtet Phloem- und nach innen gerichtet Xylemgewebe bilden. Dieser Prozess ist der Ursprung der Holzbildung, aufgrund dessen er entscheidend zur Immobilisierung atmosphärischen Kohlendioxids beiträgt. Das ringförmig geschlossene vaskuläre Kambium wird postembryonal in der Sprossachse angelegt, indem zwischen den Primärbündeln lokalisierte Zellen Kambiumidentität erlangen. Dadurch werden die Prokambiumbereiche der einzelnen Bündel verbunden. Die postembryonale Bildung eines Meristems ist ein interessanter Entwicklungsprozess, da hier sowohl Dedifferenzierung als auch eine Wiedererlangung des ursprünglichen Meristemcharakters stattfinden kann. Trotz seiner biologischen und ökonomischen Bedeutung ist die Entstehung des Kambiums und der Sekundärvaskulatur relativ wenig erforscht. Deshalb habe ich mich im ersten Teil der vorliegenden Arbeit darauf konzentriert, weiteren Aufschluss über den Prozess der Kambiumbildung zu erlangen. Molekulare Marker, die die Aktivität von an der vaskulären Entwicklung beteiligten Genen sichtbar machen, hier PXY, WOX4 und APL, wurden verwendet um deren Aktivität im Laufe der Stammentwicklung in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu verfolgen. Diesbezüglich war vor allem die Bildung des interfaszikulären Kambiums (IK) von Interesse. Die Beteiligung der Stärkescheide am Prozess der IK-Bildung wurde, unter Verwendung eines induzierbaren Reporters, durch die Verfolung der aus dieser durch Teilung hervorgegandenen Tochterzellen aufgeklärt. Durch die Untersuchung der PXY Aktivität konnte zudem gezeigt werden, dass interessanterweise nur eine einzelne, in der Stärkescheide stattfindende asymmetrische Zellteilung die IK-Bildung initiiert. Dabei wiedererlangen bereits ausdifferenzierte Zellen meristematische Identität. Die Bildung des IK stellt dadurch ein geeignetes Modell dar, um sowohl Fragen zur Erlangung von Gewebespezifität, als auch zur Regulation lateralen Pflanzenwachstums zu beantworten. Das Transkriptom, die Gesamtheit aller Transkripte in einer Zelle, ist eine unverwechselbare, die Identität einer Zelle reflektierende Signatur. Die Aufklärung gewebespezifischer Transkriptionsprofile ist entscheidend, um Verständnis über die Erlangung von Gewebespezifität und die Regulierung von Wachstum generell zu gewinnen. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit widmete sich der Methodenetablierung zur Bestimmung spezifischer Transkriptome von Geweben der Sprossachse von Arabidopsis thaliana. Hierfür wurden gewebespezifische Promotoren zunächst validiert, und im Anschluss verwendet, um die Expression des kernlokalisierten, grünfluoreszierenden Proteins (GFP) in bestimmten Sprossachsengeweben hervorzurufen. Mithilfe dieser transgenen Linien konnten unter Anwendung der sogenannten FANS-Technologie (Fluorescence-based Nucleus Sorting) Zellkerne der einzelnen Gewebe isoliert werden. Um die Methodik zur Bestimmung gewebespezifischer Transkriptome von Sprossachsengeweben zu validieren, wurde durch „Deep Sequencing“ von poy(A)-RNA zunächst das Transkriptom des Phloems ermittelt. Langfristig wird diese Methode die Basis für ein Langzeitprojekt bilden, dessen Ziel die Erstellung einer zahlreiche Gewebetypen einschließenden transkriptionellen Landkarte ist. Detaillierte Informationen über bestimmte Gene, die in einzelnen Sprossachsengeweben in Arabidopsis thaliana aktiv sind, kombiniert mit der Erforschung spezifischer Entwicklungsprozesse wie z.B. der Bildung des IK, werden die Bedeutung der Sprossachse als Modell zur Analyse der Erlangung von Gewebespezifität und Wachstumsregulation vorantreiben.Organs of multicellular organisms are complex structures, which can accommodate an extraordinary range of different cell types with very diverse functions. These different cell types are established from groups of pluripotent stem cells active at distinct phases during development or at different sites within the organism. In plants, different stem cell populations, the so called meristems, are maintained in the adult organism, allowing indeterminate growth. The shoot and root apical meristems are responsible for longitudinal growth of the plant body. In most gymnosperms and dicotyledonous species the activity of a lateral meristem, the vascular cambium, additionally allows lateral growth of the stem. This lateral meristem is located in a cylindrical domain at the periphery of growth axes and consists of meristematic cells that divide periclinally to produce phloem towards the outside and xylem towards the center of the stem. This process is the origin of wood, one of the main sinks for stable immobilization of atmospheric CO2. The vascular cambium is established post-embryonically in the shoot when cambium identity is established between primary vascular bundles in the interfascicular areas, thereby connecting the procambium from the individual vascular bundles. The post-embryonic formation of a meristem is an interesting developmental process since it may involve processes of de-differentiation and re-establishment of stem cell characters. Despite its biological and economic relevance the formation of the vascular cambium and secondary vasculature is hardly understood. Therefore, in the first part of this work, I aimed to shed light on the process of interfascicular cambium formation. Molecular markers visualizing the activity of genes regulating vascular development, in this case PXY, WOX4, and APL, were used to track gene activity domains during stem development in the model plant Arabidopsis thaliana and in particular during interfascicular cambium (IC) formation. The contribution of starch sheath cells to the process of IC formation was clarified by tracking the progeny of these cells using an inducible molecular marker. Interestingly, based on the analysis of PXY activity, IC identity is established during a single asymmetric cell division of starch sheath cells. These analyses showed that this process involves re-acquisition of meristematic identity in already differentiated cells. Therefore, the process of IC formation represents an instructive model for addressing questions regarding cell fate acquisition and the regulation of lateral plant growth. The transcriptome, the totality of all transcripts present at one stage in a cell, is one signature that reflects the cell’s distinct identity. Unraveling the tissue-specific transcriptional profiles is crucial for exploring cell fate acquisition and the regulation of growth dynamics. The second part of this study aimed at establishing a pipeline for elucidating the tissue-specific transcriptomes of the stem in Arabidopsis thaliana. To this end, tissue-specific promoters were validated and used to drive the expression of a nucleus-targeted green fluorescent protein (GFP) in different stem tissues. These transgenic lines allowed the isolation of nuclei from tissues of interest using fluorescence-based nucleus sorting (FANS). As a proof-of-principle, deep sequencing of phloem-derived poly(A)-RNA provided the transcriptional profile of the stem phloem, thereby validating the pipeline established for elucidating tissue-specific stem transcriptomes. This method will be the basis for a long term project aiming at the establishment of a transcriptional map of a comprehensive set of stem tissues. Detailed information about the genes active in individual Arabidopsis stem tissues, in combination with detailed information about developmental processes such as IC formation, will promote the role of the stem as a model for addressing questions regarding cell fate acquisition and plant growth