Photophysical characterisation of fluorescence marker and fluorescence proteins

Die komplette Aufklärung der Vorgänge in Zellen ist von besonderer Bedeutung, da nur durch die gesamte Kenntnis dieser Mechanismen ein Nutzen im Bereich des Wirkstoffdesigns und des Wirkstofftransportes möglich ist. Für weitere Erkenntnisse im Bereich der Fluoreszenzmarker, und im Speziellen der Fluoreszenzproteine, werden in dieser Arbeit Cumarin-basierte Fluoreszenzmarker an Aminosäuren und Peptiden sowie Fluoreszenzproteine charakterisiert. Cumarin-basierte Farbstoffe sind extrinsische Markierer und haben dadurch Schwierigkeiten beim Einbringen des Farbstoffes in die Zelle. Als intrinsische Farbstoffe gelten Fluoreszenzproteine (FP). Auch diese werden in dieser Arbeit charakterisiert, indem eine nicht-photokonvertierbare Mutante, das eGFP E222H, eingeführt wird. Mit dieser ist eine Kontrolle bei allen Experimenten möglich, bei denen bisher die Photokonversion als störender Faktor eine genaue Analyse unmöglich machte. Ein weiterer Nachteil von FP ist die ungenaue Angabe von komplett gereiften Chromophoren in Proteinen in der Zelle im Vergleich zur Proteingesamtanzahl in der Zelle. Die Bestimmung der Chromophorbildungseffizienz ist bei quantitativen Messungen unumgänglich. Einige Lösungsansätze mit gelbfluoreszierenden Proteinen und Aptameren zur Bestimmung der Chromophorbildungseffizienz werden in der vorliegenden Arbeit erläutert.A complete knowledge of the overall processes in cells is an aim of utmost importance for the fields of drug discovery and delivery. Further research on fluorescent markers and in particular on fluorescent proteins is the main objective of this thesis. Fluorescent markers uch as coumarins, classified as extrinsic dyes, are versatile tools for characterization of in-cell processes involving amino acids and peptides. A major limitation of extrinsic dyes is the ability to pass cell walls; fluorescent proteins (FP) circumvent this issue by already existing in cells through self-expressed proteins. That’s why FPs are categorized as intrinsic dyes. Within this thesis a non-photoconvertible mutant of GFP was introduced and characterized. This can be used as a negative control for all experiments, where photoconversion or photoactivation leads to intrinsic inaccuracy. Another disadvantage of fluorescent proteins is the difficulty in defining the ratio of correctly folded chromophores to misfolded proteins. This so-called chromophore formation efficiency is necessary for quantitative experiments. Several approaches based on aptamers and yellow fluorescent proteins for overcoming this problem are explained in here