Characterization and Role of PKCε and PKCε in Models of Normal and Aberrant Megakaryocytic Differentiation

La PKCε e la PKCδ, chinasi ubiquitariamente distribuite e ad azione pleiotropica, sono implicate del differenziamento, sopravvivenza e proliferazione cellulare. Esse sono coinvolte nel processo differenziativo delle cellule staminali ematopoietiche e in fenomeni patologici associati al compartimento sanguigno. In questa tesi sono presentati i risultati riguardanti lo studio in vitro del ruolo di PKCε e PKCδ nel contesto del differenziamento megacariocitario, in particolare si caratterizza l’espressione e la funzione di queste chinasi nel modello umano e nel modello murino di Megacariocitopoiesi, normale e patologica. Confrontando le cinetiche dei due modelli presi in analisi nello studio è stato possibile osservare come in entrambi PKCε e PKCδ dimostrino avere una chiara e specifica modulazione nel progredire del processo differenziativo. Questi dati, se confrontati, permettono di affermare che PKCε e PKCδ presentano un pattern di espressione opposto e, nel modello umano rispetto a quello murino, reciproco: nell’uomo i livelli di PKCε devono essere down-modulati, mentre nel topo, al contrario, i livelli della chinasi risultano up-modulati durante lo stesso processo. Analogamente, le CD34+ in differenziazione presentano una costante e maggiore espressione di PKCδ durante la maturazione MK, mentre nel modello murino tale proteina risulta down-modulata nella fase più tardiva di formazione della piastrina. Le chinasi mostrano in oltre di agire, nei due modelli, attraverso pathways distinti e cioè RhoA nel topo e Bcl-xL nell’uomo. È stato inoltre verificato che l’aberrante differenziamento MK osservato nella mielofibrosi primaria (PMF), è associato a difetti di espressione di PKCε e di Bcl-xL e che una forzata down-modulazione di PKCε porta ad un ripristino di un normale livello di espressione di Bcl-xL così come della popolazione di megacariociti formanti propiastrine. I dati ottenuti indicano quindi che PKCε e PKCδ svolgono un ruolo importante nel corretto differenziamento MK e che PKCε potrebbe essere un potenziale nuovo target terapeutico nelle PMF.Protein kinases C (PKC) are known to be ubiquitously distributed and to have pleiotropic effects. Isoforms epsilon (PKCε) and delta (PKCδ) are involved in the regulation of cell growth, survival and differentiation; in particular, they have been also investigated for their role in the hematopoiesis and in aberrant processes of differentiation along the erythroid and megakaryocytic lineages. In this PhD thesis, the results of an in vitro study about the role of these two kinases in models of megakaryocytic (MK) differentiation, both normal and pathological, are presented. The observations about PKCε and PKCδ kinetics show how these proteins have a specific modulation during the MK differentiation that results in an opposite pattern of expression and, in the murine model if compared with the human model, also a reciprocal one. In particular, in human megakaryocytopoiesis, PKCε results down-modulated, whereas in mouse its levels increase. Instead, PKCδ shows a high and steady expression in maturing CD34+ MK committed, but it is strongly down-modulated during the latest phases of platelet maturation in the murine model. The study also elucidates the different pathways PKCε and PKCδ work through, being an inhibitory action of PKCε on RhoA during proplatelets (ppt) formation in the mouse model while, in the human MK differentiation, platelets production is regulated by PKCδ through Bcl-xL. In this dissertation it is also demonstrated how in an aberrant megakaryocytopoiesis, as in the pathologic model of primary myeloproliferative neoplasm (PMF), PKCε is strongly deregulated and it results in an altered Bcl-xL expression. A forced down-modulation of this kinase restores a normal MK differentiation and ppt maturation. Therefore, the data presented show that PKCε and PKCδ play a key role in proper megakaryocyte maturation and that PKCε could be a potential new therapeutic target for PMF