Nanogeis de ácido hialurónico

Programa Doutoral em Engenharia Biomédica.Nanogéis poliméricos são nanopartículas que possuem uma estrutura tridimensional constituida por um polímero hidrofílico conjugado ou reticulado. O ácido hialurónico é um polissacarídeo aniónico, biodegradável, biocompatível e não-imunogénico, abundante no corpo humano. Neste trabalho descrevemos a produção de um nanogel de ácido hyalurónico através da conjugação de uma molécula hidrofóbica tiolada à cadeia hidrofílica de ácido hyalurónico. O conjugado resultante é capaz de se autoorganizar em estruturas nanométricas, em meio aquoso, de um modo versátil, fácil e reprodutível. Adicionalmente, o nanogel foi reticulado através de uma ligação dissulfito, recorrendo a um agente reticulante reativo com grupos sulfídrilo. O nanogel foi caracterizado quanto à sua estrutura, tamanho, forma, potencial zeta, estabilidade e capacidade de aprisionar moléculas hidrofóbicas. O sucesso da reticulação do nanogel foi confirmado por espectroscopia de ressonância magnética nuclear 1H, microscopia crio-eletrónica de varrimento e dispersão dinâmica de luz e comportamento em ambiente redox. O nanogel desenvolvido foi ainda estudado quanto à sua biocompatibilidade, imuno-compatibilidade e hemato-compatibilidade. Com esse intuito, o nanogel foi incubado com uma série de linhas celulares representativas de órgãos e tecido humanos, relevantes - 3T3, HMEC, A549 e RAW 264.7. O nanogel provou não afectar a atividade metabólica e proliferação celular, ou a integridade da membrana celular. Do mesmo modo, também não observamos nenhum efeito apoptótico em nenhuma das concentrações e linhas celulares testadas. Para além disso, o nanogel provou não ativar a cascata do complemento através da clivagem da proteína C3 e provou também não possuir atividade hemolítica de acordo com o Procedimento Padrão para a Avaliação da Atividade Hemolítica em Materiais, da Sociedade Americana de Testes em Materiais. Uma das características relevantes do ácido hialurónico aplicada à nano-medicina é o seu potencial de direcionamento para receptores celulares, nomeadamente receptores CD44 e Receptores de Mobilidade para o Ácido Hialurónico. Deste modo, investigamos o direcionamento do nanogel para células que sobreexpressam receptores CD44 – Cancro do pulmão das não-pequenas células. O direcionamento in vitro foi avaliado por citometria de fluxo e microscopia confocal e a biodistribuição in vivo foi avaliada por imagiologia em tempo real nãoinvasiva de infravermelho próximo (NIR). Resultados demostraram uma elevada internalização celular em células que sobreexpressam receptores CD44, in vitro, e uma seletividade in vivo para o tecido tumoral. Também quisemos estudar a influência das sondas NIR usadas nos estudos de biodistribuição. Portanto, desenvolvemos um estudo comparativo da farmacocinética in vivo, de duas sondas de NIR diferentes – Cy5.5 e Alexa Fluor 680. Por fim, estudamos o mecanismo de endocitose através do qual o nanogel interage com as células recorrendo à tecnologia de siRNA para regular a expressão de proteínas alvo envolvidas no processo de endocitose. Os resultados revelaram que, o nanogel é internalizado por um mecanismo dependente de energia que parece ser mediada pela Caveolina e também pela Claterina. Finalmente, o nanogel foi usado como veículo para o transporte de rifampicina ou outros péptidos antimicrobianos, no tratamento de macrofagos infectados com Mycobacterium. Em resumo, o nanogel apresenta características promissoras como sistema reticulado, no direcionamento de fármacos via endocitose mediada por receptors para o ácido hialurónico.Polymeric nanogels are hydrogel nanoparticles with a tridimensional structure that consist in a conjugated or crosslinked hydrophilic polymer. An exquisite representative of this group of polymers is, hyaluronic acid. Hyaluronic acid is an anionic polysaccharide biodegradable, biocompatible and non-imunogenic, ubiquitous of the human body. The present work comprehends the production of a hyaluronic acid nanogel by the conjugation of a thiolated hydrophobic molecule to the hydrophilic backbone of hyaluronic acid. The resulting conjugate is able to self-assemble in aqueous environment into nanosized structures in a versatile, easy and reproducible manner. Further, nanogel was crosslinked by dissuldie bond, resourcing to a sulfhydryl reactive homobifunctional crosslinker. Nanogel were characterized as to its - structure, size, shape, zeta potential, stability and ability to entrap small hydrophobic molecules. Also, reticulation was confirmed by 1HNMR, UV–Vis spectroscopy, cryo-field-emission scanning electron microscopy, dynamic light scattering characterization and redox-sensitive performance. Engineered nanogel was further studied as to its biocompatibility, immunocompatibility and hemocomptability. For that purpose, nanogel was incubated with a collection of cell lines representative of relevant human tissues - 3T3, HMEC, and RAW 264.7 cells. Nanogel proved to not affect cells metabolic activity and proliferation, or cellular membrane integrity. Also, we didn’t observe any apoptotic effect at any nanogel concentration and cell lines tested, using the Annexin V-FITC test. Moreover, nanogel proved to not activate the complement cascade by C3 cleavage and to be non-hemolytic according to Standard Practice for Assessment of Haemolytic Properties of Materials from the American Society for Testing Materials. Among the exciting features of hyaluronic acid in nanomedicine applcations is the potential of active targeting for cell surface receptors, namely CD44 and Receptor for Hyaluronan Mediated Motility. Thus, we investigated nanogel targetability, towards CD44 over-expressing cells – Non-small cancer lung cells. In vitro and in vivo targeting was assessed by flow cytometry and confocal fluorescence microscopy and non-invasive real time near-infrared (NIR) imaging in healthy and tumour bearing mice. Results revealed high in vitro cellular uptake by CD44 overexpressing cells and in vivo selective targeting towards tumour tissue. We also investigated the influence of the NIR probe used in biodistribution studies. For that reason, we performed a comparative study of in vivo pharmacokinetics of two different NIR probes - Cy5.5 and Alexa Fluor 680. We further studied the endocytic mechanism through which nanogel interacted with cells interface resourcing to siRNA machinery to regulate expression of key endocytic proteins. Results revealed that nanogel endocytosis occurs through an energy dependent pathway and seems to occur predominantly through caveolae-mediated endocytosis and also, clatherin-mediated endocytosis. Finaly, the HyA-AT nanogel was subsequently tested as drug carrier for the intracellular delivery of Rifampicin or an antimicrobial peptide to Mycobacterium infected macrophages. Our data collectively suggest that HyA-AT nanogel may have potential as intracellular delivery system of therapeutic cargo via endocytosis mediated by hyaluronic acid receptors