Mitochondria and endoplasmic reticulum interplay at the core of efavirenz-induced hepatic effects

El inhibidor de la transcriptasa inversa no análogo de nucleósido efavirenz (EFV) es uno de los fármacos más utilizados en la terapia antirretroviral combinada (TARc) empleada en el tratamiento de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Aunque en general se ha considerado seguro, existe una gran preocupación acerca de los efectos secundarios inducidos por las terapias que contienen EFV. Este fármaco se ha asociado con toxicidad hepática y trastornos metabólicos y, aunque los mecanismos implicados no están claros, evidencias recientes han señalado una acción mitocondrial específica de EFV acompañada por la inducción de estrés de retículo endoplasmático (RE)/respuesta a proteínas desplegadas en células hepáticas humanas cultivadas. En el presente trabajo, con el objetivo de entender el papel de la mitocondria en los efectos inducidos por EFV, en primer lugar, hemos evaluado las acciones celulares de este fármaco en un modelo de células hepáticas que carecen de mitocondrias funcionales (células rho⁰ generadas en el fondo Hep3B). Además, hemos estudiado la dinámica mitocondrial, en células Hep3B wild-type, que depende entre otros procesos de la interacción entre las mitocondria y el RE. Esta interacción también se ha analizado mediante la evaluación de las membranas asociadas a la mitocondria (MAMs). Por último, con el fin de vincular aún más los dos efectos de EFV (mitocondria y RE), hemos analizado la expresión de LONP1, una proteasa mitocondrial altamente conservada cuya activación es un mecanismo adaptativo tanto en el estrés oxidativo como en el de RE. A lo largo del manuscrito, los efectos de EFV se han comparado con los inducidos por un inductor farmacológico clásico del estrés de RE, tapsigargina (TG), el agente mitotóxico típico rotenona (Rot) - un inhibidor estándar del complejo I - y el desacoplador de la OxPhos, CCCP. Por un lado, las células rho⁰ tratadas con EFV mostraron una reducción importante en los parámetros indicativos de interferencia mitocondrial, tales como aumento de la producción de superóxido, alteraciones en la morfología y masa mitocondrial, y aumento de la expresión de LONP1. En consonancia con estos resultados, el efecto citotóxico (número de células, condensación de la cromatina, alteraciones del ciclo celular e inducción de la apoptosis) de EFV fue menos pronunciado en las células Hep3B deficientes de respiración que en las células wild-type. El efecto de EFV fue tanto similar como diferente de los efectos producidos por dos factores distintos de estrés mitocondrial, TG y Rot, dependiendo del parámetro estudiado. Por otro lado, los marcadores de la dinámica mitocondrial se expresaron de forma diferente con los estímulos utilizados (EFV, TG, Rot y CCCP), lo que apunta a una especificidad del doble estrés mitocondrial/RE inducido por EFV. El tratamiento con EFV potenció la interacción entre la mitocondria y el RE, como se muestra por los experimentos de co-inmunoprecipitación de los complejos proteicos de las MAMs. Además, LONP1 fue regulado positivamente tanto a nivel de ARNm como de proteína en todas las condiciones. Sorprendentemente, tras el tratamiento con EFV, su presencia extramitocondrial (RE y MAMs) aumentó. En conclusión, las células hepáticas que carecen de mitocondrias normales (rho⁰) son menos vulnerables a EFV. Este hallazgo puede explicar las reacciones hepáticas idiosincrásicas desencadenadas por los fármacos anti-VIH y también los diferentes grados de susceptibilidad al daño hepático observados en pacientes sometidos a terapia antirretroviral. El doble efecto mitochondria-RE específico inducido por EFV aumenta el contenido de MAMs y esto está asociado con el aumento de la expresión extramitochondrial de LONP1. Este es el primer informe de este fenómeno en células de mamífero y sugiere una función novedosa de LONP1 relacionada con las MAMs.The non-nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor efavirenz (EFV) is among the most widely used drugs in the combined antiretroviral therapy (cART) employed in the treatment of human immunodeficiency virus (HIV) infection. Although generally considered safe, there is a concern about the side effects induced by EFV-containing therapies. It has been associated with hepatic toxicity and metabolic disturbances and, although the mechanisms involved are not clear, recent evidence has pinpointed a specific mitochondrial action of EFV accompanied by the induction of an endoplasmic reticulum (ER) stress/unfolded protein response in cultured human hepatic cells. In the present work, in order to understand the role of mitochondria in the effects of EFV, firstly, we have assessed the cellular actions of this drug in a model of hepatic cells that lack functional mitochondria (rho⁰ cells generated in Hep3B background). In addition, we have studied mitochondrial dynamics, in wild-type Hep3B cells, which depends among other processes on the interaction between mitochondria and ER. This interaction has also been analysed by evaluation of mitochondrial-associated membranes (MAMs). Finally, in order to further link the two effects of EFV (mitochondria and ER), we have analysed the expression of LONP1, a highly conserved mitochondrial protease whose activation is an adaptive mechanism in both oxidative and ER stress. Throughout the manuscript, the effects of EFV have been compared to those induced by the classic pharmacological inducer of ER stress thapsigargin (TG), the typical mitotoxic agent rotenone (Rot) - a standard complex I inhibitor - and the uncoupler of OxPhos CCCP. On the one hand, EFV-treated rho⁰ cells exhibited a substantial reduction in parameters indicative of mitochondrial interference, such as increased superoxide production, mitochondrial mass/morphology alterations and enhanced expression of LONP1. In line with these results, the cytotoxic effect (cell number, chromatin condensation, cell cycle alterations and induction of apoptosis) of EFV was less pronounced in Hep3B respiration-depleted cells than in wild-type cells. The effect of EFV was both similar and different from those of two distinct mitochondrial stressors, TG and Rot, depending on the parameter studied. On the other hand, markers of mitochondrial dynamics were expressed differentially with the stimuli used (EFV, TG, Rot and CCCP), which points to a specificity of the dual ER/mitochondrial stress induced by EFV. EFV treatment enhanced mitochondria/ER interorganelle interaction, as shown by co-immunoprecipitation experiments of MAMs protein partners. In addition, LONP1 was upregulated at mRNA and protein levels under all conditions. Surprisingly, upon treatment with EFV, its extramitochondrial presence (ER and MAMs) increased. In conclusion, hepatic cells lacking normal mitochondria (rho⁰) are less vulnerable to EFV. This finding may account for the idiosyncratic hepatic reactions triggered by anti-HIV drugs and may also explain the different degrees of susceptibility to liver damage seen in patients undergoing antiretroviral therapy. The specific dual mitochondria-ER effect induced by EFV enhances MAMs content and this is associated with increased extramitochondrial LONP1 expression. This is the first report of this phenomenon in mammalian cells and suggests a novel MAMs-linked function of LONP1