Bases moleculares de la presentación de ligandos fosforilados por moléculas HLA-B

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 20-05-2016Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 20-11-2017Major Histocompatibility Complex (MHC, HLA in humans) class I molecules play a key role in the eradication of viral infections and tumor transformation processes. Its primary function is the presentation to cytotoxic T lymphocytes (CTLs) of a broad peptide repertoire generated from the degradation of endogenous proteins. Recognition of an antigenic peptide in the context of a class I molecule leads to the activation of the CTL which exerts its cytotoxic activity on the antigen presenting cell. The peptidome displayed by HLA-I molecules includes phosphorylated ligands. These have been proposed as optimal targets for the treatment of cancer by T cell-based immunotherapy. Using HLA-B*40 as a model, we set out to study the peptidome and phosphopeptidome presented by HLA-I molecules and to determine the molecular basis of the presentation of phosphorylated ligands. LC-MS/MS analysis of the peptide repertoire associated with B*40 allowed us to characterize more than 9500 unique ligands with a common anchor motif: acidic residues –mainly Glu– at P2 and, aliphatic residues Met or Phe at PΩ. The structural determinants of this motif were analyzed by solving the crystallographic structure of B*40 in complex with an endogenous ligand. By using phosphopeptide enrichment methods, we were able to identify around 150 phosphorylated ligands displayed by this allotype. Analysis of this set of sequences revealed two striking facts: 1) some ligands had phosphoserine (pSer) instead of Glu at P2 and 2) phosphorylation frequently affected the residue at P4 and was accompanied by the presence of a basic residue at P1. By means of binding assays to B*40 and X-ray crystallography we could determine that the presentation of ligands phosphorylated P2 is explained by molecular mimicry between the residues Glu and pSer. Furthermore, we demonstrated that the preference for phosphorylated peptides at P4 is related to the presence of the residue Arg62 in the heavy chain of this allotype and that the selection of basic residues at P1 is a consequence of the structure of the A pocket. Finally, the analysis of the phosphopeptidome displayed by HLA-B*39 showed that this is also enriched in ligands phosphorylated at P4 but with a lower frequency of positively charged residues at P1. This allows to anticipate that the preference for peptides phosphorylated at P4 is a common feature for most HLA-B molecules while the bias towards basic residues at P1 is allotype-dependent. This understanding of the molecular basis for the presentation of phosphopeptides by HLA-B molecules may contribute to the identification and prediction of phosphorylated epitopes for the treatment of cancer by T cell-based immunotherapyLas moléculas de clase I del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC, HLA en humanos) desempeñan un papel fundamental en la erradicación de infecciones virales y procesos de transformación tumoral. Su función primordial es la presentación a los linfocitos T citotóxicos (CTLs) de un amplio repertorio peptídico generado a partir de la degradación de proteínas endógenas. El reconocimiento de un péptido antigénico en el contexto de una molécula de clase I conduce a la activación del CTL que ejerce su acción citolítica sobre la célula presentadora. El peptidoma presentado por las moléculas HLA-I incluye ligandos fosforilados. Estos han sido propuestos como dianas óptimas para el tratamiento del cáncer por inmunoterapia basada en células T. Usando HLA-B*40 como modelo, nos propusimos estudiar el peptidoma y fosfopeptidoma presentado por moléculas HLA-I y determinar las bases moleculares de la presentación de ligandos fosforilados. El análisis por LC-MS/MS del repertorio peptídico asociado a B*40 nos permitió caracterizar más de 9500 ligandos únicos con un motivo de anclaje común: residuos ácidos –fundamentalmente Glu– en P2 y residuos alifáticos, Met o Phe en PΩ. Los determinantes estructurales de este motivo fueron analizados mediante la resolución de la estructura cristalográfica de B*40 en complejo con un ligando endóngeno. Gracias al uso de métodos de enriquecimiento de fosfopéptidos, pudimos identificar en torno a 150 ligandos fosforilados presentados por este alotipo. El análisis de este conjunto de secuencias reveló dos hechos llamativos: 1) algunos ligandos presentaban fosfoserina (pSer) en lugar de Glu en P2 y 2) la fosforilación afectaba frecuentemente al residuo en P4 e iba acompañada por la presencia de un residuo básico en P1. Mediante ensayos de unión a B*40 y cristalografía de rayos X pudimos determinar que la presentación de ligandos fosforilados en P2 se explica por el mimetismo molecular entre los residuos de pSer y Glu. Por otra parte, demostramos que la preferencia por péptidos fosforilados en P4 está relacionada con la presencia del residuo Arg62 en la cadena pesada de este alotipo y que la selección de residuos básicos en P1 es consecuencia de la estructura de la subcavidad A. Por último, el análisis del fosfopeptidoma presentado por HLA-B*39 demostró que este también está enriquecido en ligandos fosforilados en P4 aunque con una menor frecuencia de residuos cargados positivamente en P1. Este hecho, permite anticipar que la preferencia por péptidos fosforilados en P4 es una característica común a la mayoría de moléculas HLA-B mientras que el sesgo hacia residuos básicos en P1 es dependiente de alotipo. El conocimiento de las bases moleculares de la presentación de fosfopéptidos por moléculas HLA-B puede contribuir a la identificación y predicción de epítopos fosforilados para el tratamiento del cáncer mediante inmunoterapia basada en células