Del gen a la patofisiología: Nuevas enfermedades asociadas al catabolismo de los aminoácidos ramificados

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 14-06-2016Los aminoácidos de cadena lateral ramificada (BCAAs, por sus siglas en inglés - Branched- Chain Amino Acids) son elementos clave en el metabolismo y señalización celular. Su catabolismo es un proceso eminentemente mitocondrial que empieza con una transaminación seguida de una descarboxilación oxidativa catalizada por el complejo multienzimático mitocondrial BCKDH. Los defectos en el catabolismo temprano de los BCAAs resultan en una enfermedad rara de caracter neurológico y fatal desarrollo conocida como “enfermedad de la orina de jarabe de arce” o MSUD, claro ejemplo de la importancia de su correcto catabolismo en la salud. A lo largo de este trabajo hemos descrito un grupo de pacientes con nuevas enfermedades asociadas al metabolismo de los BCAAs. Estos fueron referidos a nuestro laboratorio en base a su perfil metabólico en plasma y a la sospecha clínica de una metabolopatía. Basándonos en su estratificación buscamos la causa genética responsable de la patología mediante el empleo de las diferentes tecnologías disponibles para el diagnóstico genético. En el primer caso descrito encontramos la mutación causante de patología mediante la descripción previa de una región de pérdida de heterozigosidad que abarcaba el cromosoma 4 entero. Esto dirigió nuestra atención hacia el gen PPM1K, que codifica para la fosfatasa PP2Cm, propuesta en modelos animales como la reguladora positiva de la actividad del complejo BCKDH. Confirmamos una deleción en homozigosis de dos pares de bases en dicho gen, que causaba un cambio en la fase de lectura, resultando en la aparición a 5’ de un codón de parada prematura. El subsiguiente análisis del efecto de la mutación confirmó la relación entre la pérdida de función de PP2Cm con la disminución e la actividad de BCKDH, responsable del fenotipo de MSUD descrito en el paciente. En el segundo grupo de pacientes se diagnosticó un defecto en la quinasa reguladora del complejo BCKDH, la proteína BCKDK. Estos pacientes se caracterizaban por un comportamiento de tipo autista, asociado a retraso mental y de crecimento y a una disminución en la concentración de BCAAs en plasma. El primer paso para el diagnóstico fue la determinación de dicho perfil bioquímico como la firma metabólica de la enfermedad, lo que se consiguió mediante la caracterización de la tasa de metabolismo de la [U-13C]-leucina en fibroblastos en cultivo. Posteriormente caracterizamos dos mutaciones de péridida de función en el gen BCKDK, c.520C>G y c.1166T>C, responsables del fenotipo molecular descrito. BCKDK es responsable de la fosforilación e inactivación del complejo BCKDH, con lo que un defecto en la quinasa supone la activación constitutiva del complejo. En el caso del último paciente realizamos un estudio de Secuenciación Masiva (NGS) en el que se evaluaron las regiones exónicas codificantes de más de 4.800 genes. Mediante la aplicación de una serie de filtros lógicos encontramos una mutación en el gen BCAT2, que codifica para la transaminasa mitocondrial responsable del primer paso del metabolismo de los BCAAs. En la búsqueda de dianas de acción para el tratamiento de la enfermedad dirigimos nuestra investigación hacia el estudio de la función mitocondrial tras la alteración en la regulación del metabolismo (tanto por defecto en PP2Cm como en BCKDK) por diversas razones. En primer lugar, debemos recordar que el metabolismo de los aminoácidos ramificados es un proceso mitocondrial en si mismo. En suma a esto, PP2Cm había sido descrita como una proteína esencial en la función mitocondrial en modelos animales, y se han descrito alteraciones mitocondriales en la etiopatogénesis de diversos tipos de autismo, haciendo de la mitocondria un objeto interesante de estudio. Encontramos un incremento en la producción de O2 ·- en ambas situaciones, especialmente llamativo en los fibroblastos de los pacientes BCKDK. La valoración de las tasas de consumo de oxígeno revelaron una disminución en las respiraciones basal y asociada a ATP, que se reflejaron en una reducción en la concentración de ATP celular. Mediante los análisis posteriores no pudimos ratificar la implicación de PP2Cm en el poro de transición mitocondrial mPTP, tal y como se había descrito en otros modelos, pero si confimamos una relación con la sensibilidad a la supervivencia celular, registrada como un incremento en la activación de rutas MAPK y sobreexpresión de ciertos genes proapoptóticos. Con todo esto, queda aún por determinar qué elementos del fenotipo descrito se deben a los aumentos en BCAAs y cuales a la deficiencia en PP2Cm en si misma. Al analizar la respuesta mitocondrial al estado hiper catabólico debido a la deficiencia en BCKDK observamos mitocondrias más alargadas y con forma más tubular en los fibroblastos de los pacientes, así como un aumento en la expresión de las proteínas relacionadas con la fusión mitocondrial OPA1 y Mfn2, resultados que se reprodujeron en fibroblastos control interferidos para BCKDK. Estos resultados apuntan hacia la existencia de diversos mecanismos mitocondriales para mitigar el daño causado por el decremento en las concentraciones de aminoácidos, otorgando a la mitocondria una posición relevante en el desarrollo de la patología. Nuestros resultados ensalzan la importancia en el equilibrio del metabolismo de los BCAA. La descripción de nuevos genes implicados en una ruta metabólica permiten la definición o validación de una aproximación terapéutica a la enfermedad, y avala la bísqueda de nuevas dianas de acción dirigidas contra las diferencias partes de la enfermedadBranched-Chain Amino Acids (BCAAs) are key elements in cell metabolism and signaling. Their catabolism is mainly a mitochondrial process that starts with a transamination followed by an irreversible oxidative decarboxylation, catalyzed by the mitochondrial multienzymatic complex BCKDH. Defects on the early catabolism of BCAAs result in the neurological fatal rare disease Maple Syrup Urine Disease, providing a clear insight of the importance of their correct metabolism in health. Throughout this work we have described a set of patients with novel diseases related to BCAA metabolism. The patients were referred to our lab due to their blood metabolites profile and clinical diagnosis. Based on such stratification, we sought the genetic cause underlying the pathology, relying on different technologies for genetic diagnosis. In the first case reported we found the disease-causing mutation upon the description of a region of loss of heterozigosity that ranged the whole chromosome 4. These results pointed our attention towards PPM1K gene, coding for the phosphatase PP2Cm, thought to be the phosphatase positively regulating BCKDH complex activity. We confirmed an homozygous deletion of two base pairs on such gene, causing a frame shift that resulted in an upstream premature stop codon. Further analysis of the mutation effect confirmed the relationship of the loss of PP2Cm function with a decreased BCKDHc activity, responsible for the MSUD-like metabolic pattern found in the patient. The diagnosis of a defect in BCKDHc-regulating kinase BCKDK in the second set of patients, characterized by an autistic-like behavior with growth and mental retardation and a decrease in BCAAs blood concentration, involved the establishment of such decrease as the metabolic signature for the disease, achieved through characterization of the metabolism rate of [U-13C]-Leucine in cultured fibroblasts. We found two loss-of-function mutations in BCKDK, c.520C>G and c.1166T>C, proved to be causing the described molecular phenotype. BCKDK is responsible for the phosphorylation and inactivation of BCKDH complex, so a defect in the kinase results in its constitutive activation. As for the last patient, a Next Generation Sequencing study was performed, evaluating the coding exons of over 4.800 genes. Through the establishment of a few logic filters we found a mutation in BCAT2, coding for the mitochondrial transaminase responsible of the first step of BCAA metabolism. On the search of actionable targets for disease treatment we pointed our research towards the study of the mitochondrial performance upon disruption in the BCAA metabolism regulation (both absence of PP2Cm and of BCKDK) for several reasons. We must recall that branched chain amino acids metabolism is a mitochondrial process itself. On top of that, PP2Cm had been described as a critical mitochondrial protein in animal models, and mitochondrial alterations have been described in the etiopathogenesis of some types of autism. We found an increase in O2 ·- production in both states, specially significant in the BCKDK patients’ cells, in which the increase recorded was over two-fold. Appraisal of oxygen consumption rates revealed a decrease in the basal and ATP-linked respiration, that was indeed echoed in a great reduction of ATP cellular concentration. On further analysis, we couldn’t ratify the implication of PP2Cm in mPTP, as had been described in other models, but we did confirm an implication in cell survival sensitivity, as we registered an increase in MAPK activation and overexpression of certain pro-apoptotic genes. Therefore, it is still unclear what part of the phenotype described accounts for the BCAAs and what for PP2Cm defficency itself. Once analyzing the mitochondrial response to the hyper-catabolic state due to BCKDK deficiency, we registered more elongated and tubular mitochondria and increased fusion-related proteins Mfn2 and OPA1, results reproduced in BCKDK-interfered control fibroblasts. These results point towards diverse mitochondrial mechanisms to mitigate the damage caused by the decrease in amino acids, through the shape and funcion relationship, placing the mitochondria in a relevant position in the disease development. Our results highlight the importance of the equilibrium in the BCAA metabolism regulation. The description of new genes involved in a metabolic route allows the definition or validation of a therapeutic approach to the disorder, and empowers the search of novel actionable pathways that address the different facets of the diseas