Protocol optimization for production of doubled haploid plants through the isolated microspore culture of wheat

In Brazil, the wheat crop occupies an outstanding place in the production systems of the Southern Region, representing a very important option as a winter cereal. Genetic improvement of self-fertilizing crops has relied on several methods to produce newer and superior cultivars with enhanced traits. A very successful example has been the use as double haploids as a method to accelerate the development of a new cultivar. In wheat, isolated microspore culture has been used to obtain doubled haploid plants. However, this technique has been characterized as highly genotype dependent and producing high rates of albino plants. Thus, the objective of this work was to optimize a protocol through the in vitro culture of isolated microspores utilizing a wheat genotype with high production of albino plants. For this study, F1 plants originated from the wheat cross between Toropi x BRS 194 were used as microspore donor plants. Three experiments were carried out. In the first experiment, anthers were treated in three pre-treatment solutions, at 4°C: a) mannitol (62 g L-1) + 15 µM copper sulphate (CuSO4.5H20); b) mannitol (62 g L-1) and c) 15 µM copper sulphate. In the second experiment, the same pre-treatment solutions of the previous experiment were tested, with the difference that in this experiment, whole spikelets were used for the pre-treatment. In the third experiment, only cold pre-treatment was applied to the spikes, and there was a modification in the induction medium, when nine treatments were tested: control (standard induction medium); copper sulphate (2,0 µM); proline (10 mM); glutathione (2,0 µM); cefotaxime (100 mg L-1); copper sulphate (4,0 µM); copper sulphate (2,0 µM) + proline (10 mM); copper sulphate (2,0 µM) + glutathione (2,0 µM); copper sulphate (2,0 µM) + cefotaxime (100 mg L-1). Results obtained in experiments 1 and 2 showed that the pre-treatment solution containing 15 µM of copper sulphate was more efficient to trigger the embryogenesis of microspores and regenerate green plants in wheat. In the third experiment, the induction medium, supplemented with 100 mg L-1 of cefotaxime showed an increase in the formation of embryos and also in the regeneration of green plants.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESNo Brasil, a cultura do trigo ocupa lugar de destaque nos sistemas de produção da Região Sul, representando uma opção muito importante como um cereal de inverno. O melhoramento genético das culturas autógamas tem contado com vários métodos para produzir cultivares mais recentes e superiores com características melhoradas. Um exemplo muito bem sucedido tem sido o método de produção de plantas duplohaploides usado para acelerar o desenvolvimento de uma nova cultivar. Em trigo, a cultura de micrósporos isolados tem sido usada para a obtenção de plantas duplohaploides. No entanto, esta técnica tem sido caracterizada como altamente genótipo-dependente e de produzir altas taxas de plantas albinas. Assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar um protocolo através da cultura in vitro de micrósporos isolados utilizando-se genótipo de trigo com alta produção de plantas albinas. Para este estudo, plantas F1 oriundas do cruzamento de trigo entre Toropi x BRS 194 foram usadas como doadoras de micrósporos. Foram realizados três experimentos. No primeiro experimento, anteras foram removidas das espiguetas e tratadas em três soluções de pré-tratamentos à 4°C: a) manitol (62 g L-1) + 15 µM de sulfato de cobre (CuSO4.5H20); b) manitol (62 g L-1) e c) 15 µM de sulfato de cobre. No segundo experimento, foram testadas as mesmas soluções de pré-tratamento do experimento anterior, com a diferença de que neste experimento, espiguetas inteiras foram usadas para o pré-tratamento. No terceiro experimento, somente o pré- tratamento a frio foi aplicado nas espigas e houve uma modificação no meio de indução, quando foram testados nove tratamentos: controle (meio de indução padrão); sulfato de cobre (2,0 µM); prolina (10 mM); glutationa (2,0 µM); cefotaxima (100 mg L-1); sulfato de cobre (4,0 µM); sulfato de cobre (2,0 µM) + prolina (10 mM); sulfato de cobre (2,0 µM) + glutationa (2,0 µM); sulfato de cobre (2,0 µM) + cefotaxima (100 mg L-1). Os resultados obtidos nos experimentos 1 e 2 mostrou que a solução de pré-tratamento contendo 15 µM de sulfato de cobre foi mais eficiente para desencadear a embriogênese dos micrósporos e regenerar plantas verdes em trigo. No terceiro experimento, o meio de indução suplementado com 100 mg L-1 de cefotaxima mostrou um aumento na formação de embriões e também na regeneração de plantas verdes