Le dosage de vitamines du groupe B (acide pantothénique et cobalamines) dans les aliments après isolement chromatographique et détection fluorimétrique

La méthode mise au point pour le dosage de l’acide pantothénique libre consiste en une purification des échantillons par passages successifs sur des cartouches échangeuses d’anions et de cations, puis en un isolement chromatographique en phase inverse suivi d’une dérivation post-colonne de l’acide pantothénique en isoindole fluorescent (réaction de la β-alanine, obtenue par hydrolyse alcaline à chaud de l’acide pantothénique, avec l’ortho-phthaldialdéhyde en présence d’acide mercaptopropionique). Une hydrolyse enzymatique (pepsine, puis pantéthéinase et phosphatase alcaline), effectuée avant l’étape de purification, permet de libérer l’acide pantothénique lié et ainsi d’obtenir la teneur en vitamine B5 totale dans les aliments. En ce qui concerne la vitamine B12 libre, le protocole proposé comporte une purification très spécifique par passage sur colonne d’immunoaffinité, avec concentration de l’échantillon, puis une transformation de la vitamine en ribazole (hydrolyse alcaline à chaud, puis traitement par une phosphatase alcaline). Le ribazole obtenu est par la suite dosé par fluorimétrie après un isolement chromatographique en phase inverse. Un traitement par la pepsine permet de libérer les différentes formes de la vitamine B12 liées à des protéines et ainsi de pouvoir estimer la teneur en vitamine B12 totale dans les aliments. Ces méthodes, sensibles et répétables, donnent de bons taux de recouvrement. Etant données leur faible limite de détection (0,65 µg.g-1 pour la vitamine B5 et 1 ng.g-1 pour la vitamine B12) et la bonne résolution des pics chromatographiques (respectivement d’acide pantothénique et de ribazole), elles devraient pouvoir très vraisemblablement être utilisées pour la détermination de ces vitamines dans n’importe quel échantillon alimentaire. The developped method for the free pantothenic acid consists of a purification of the samples by successive passages through anion and cation exchange cartridges, then an isolation by reversed-phase chromatography followed by a post-column derivatization of pantothenic acid as a fluorescent isoindole (reaction of β-alanin, formed by hot alkaline hydrolysis of pantothenic acid, with ortho-phthaldialdehyde in the presence of mercaptopropionic acid). An extraction procedure in two steps, first treatment by pepsin (hydrolysis of forms bound to proteins), then treatment by alkaline phosphatase and pantetheinase (hydrolysis of coenzyme A), allows to release the total vitamin B5 in the pantothenic acid form. As for free vitamin B12, the proposed protocol contains a very specific purification by passage through an immunoaffinity column, with concentration of the extract, then a transformation of the vitamin into ribazole (obtained by hot alkaline hydrolysis followed by a treatment by alkaline phosphatase). The fluorescent compound is then analysed by fluorimetry after a separation by reversed-phase chromatography. An enzymatic hydrolysis by pepsin allows to release the different forms of vitamin B12 bound to proteins and thus to obtain an estimation of the total vitamin B12 amount. These sensitive and repetable methods give good recovery rates. Owing to their low detection limit (0,65 µg.g-1 for the vitamin B5 and 1 ng.g-1 for the vitamine B12) and the good resolution of the peaks (respectively of pantothenic acid and of ribazole), they could most probably be applied to the determination of these vitamins in any foodstuff