Functional studies of PPR proteins in Arabidopsis organelles

Dans les organites de plantes, les étapes post- transcriptionnelles sont régulées par des protéines codées par le noyau et adressées aux organites. Chez les plantes, les protéines de la vaste famille PPR (PentatricoPeptide Repeat), sont des acteurs majeurs de cette régulation. Nous avons utilisé une stratégie de génétique inverse afin d'identifier les rôles de protéines PPR chez Arabidopsis thaliana. Dans les organites de plantes supérieures, l'édition de l'ARN convertit spécifiquement certains résidus cytidine en uridine dans les transcrits. La spécificité de reconnaissance de ces sites est assurée par des trans-facteurs protéiques qui lient l'ARN en amont du site d'édition. Nous avons identifié six nouveaux facteurs d'édition PPR dans les chloroplastes d'Arabidopsis thaliana (OTP80, OTP81, OTP82, OTP84, OTP85 et OTP86). Ces facteurs sont impliqués dans l'édition de 9 cytidines distinctes et certains reconnaissent plusieurs sites. Une analyse bio-informatique conduite sur les séquences cibles des trans-facteurs PPR reconnaissant plusieurs sites d'édition, suggère que leur spécificité de reconnaissance peut être expliquée si le facteur d'édition reconnait certains nucléotides conservés et distingue les résidus pyrimidines et purines. Lors d'une seconde étude, nous avons identifié un gène essentiel pour le développement de l'embryon chez Arabidopsis. Ce gène code pour une nouvelle protéine PPR, PPR9. Des expériences de fusion à la GFP, d'immunodétection et d'immunohistochimie ont montré que PPR9 est à la fois localisée dans les mitochondries et le noyau des cellules. Des expériences de complémentation génétique prouvent que seule la localisation mitochondriale est essentielle au développement de l'embryon. PPR9 lie l'ARN in vitro et est associée avec les polysomes des mitochondries de plantes. La protéine interagit avec la protéine NAP1 (Nucleosome Assembly Protein1) et le facteur de transcription TCP8. L'ensemble des données suggère que PPR9 régule l'expression des gènes mitochondriaux et nucléaires.In plant organelles, nuclear encoded proteins targeted to the organelles control post-transcriptional mechanisms. The PentatricoPeptide Repeat proteins (PPR) whose family has greatly expanded in land plants, are good candidates to play such regulatory roles. We used a reverse genetic screen in Arabidopsis thaliana to assign new functions to PPR genes. RNA editing in higher plant organelles results in the conversion of specific cytidine residues to uridine residues in RNA. The recognition of a specific target C site by the editing machinery involves trans-acting factors that bind to the RNA upstream of the C to be edited. We identified six new PPR chloroplast editing factors in Arabidopsis thaliana (OTP80, OTP81, OTP82, OTP84, OTP85, and OTP86). These six factors account for nine editing sites not previously assigned to an editing factor and, together with the nine PPR editing proteins previously described, explain more than half of the 34 editing events in Arabidopsis chloroplasts. An analysis of the target sites requiring the editing factors involved in editing of multiple sites suggests that editing factors can generally distinguish pyrimidines from purines and, at some positions, must be able to recognize specific bases. Secondly, we report that loss-of-function mutations of PPR9 are lethal for the embryo in Arabidopsis thaliana. PPR9 encodes a novel PPR protein dual localized to mitochondria and nuclei as observed by GFP fusions, immunoblots using anti-PPR9 antibodies on sub-cellular fractions and immunohistochemistry experiments. Genetic complementation showed that loss of PPR9 function in mitochondria is lethal for the embryo but not in nuclei. PPR9 is able to bind RNA. In mitochondria, it is associated with polysomes and may play a role in translation, whereas, in the nucleus, PPR9 interacts with the nucleosome assembly protein NAP1 and the transcription factor TCP8. Altogether, our findings suggest that PPR9 might be involved in gene expression regulation between mitochondria and the nucleus