Régulation de la neurostéroïdogenèse dans la moelle épinière et le système limbique par la gelsémine et Gelsemium sempervirens : analyse cellulaire et implications neurophysiologiques.

Les neurones et les cellules gliales synthétisent des stéroïdes bioactifs ou neurostéroïdes qui contrôlent divers processus neurophysiologiques. Plusieurs études ont démontré que le neurostéroïde alloprégnanolone (3α,5α-THP), qui est un puissant activateur de la neurotransmission inhibitrice, module efficacement la nociception et l’anxiété en agissant par un mode paracrine et/ou autocrine. En conséquence, une hypothèse a émergé dans la littérature suggérant que les substances capables de stimuler la production de 3α,5α-THP dans le système nerveux central (SNC) seraient intéressantes pour l’élaboration de stratégies efficaces contre l’anxiété et la douleur. Toutefois, pour être thérapeutiquement efficaces, les substances candidates doivent être dénuées des effets secondaires tels que les nausées, la dépendance ou les troubles respiratoires provoqués par la majorité des antalgiques et anxiolytiques actuellement disponibles. Depuis plusieurs années, les Laboratoires BOIRON commercialisent les préparations homéopathiques de Gelsemium sempervirens (G. sempervirens) comme des médicaments anxiolytiques et antalgiques n’induisant pas d’effets indésirables. Or, les propriétés thérapeutiques attribuées à ces médicaments homéopathiques ne s’appuient sur aucune preuve scientifique issue d’une recherche fondamentale. En particulier, il n’existe pas de données sur les effets cellulaires et les mécanismes d’action de G. sempervirens dans le SNC. Dans le but de clarifier cette situation ambiguë, il nous a paru indispensable d’étudier d’abord l’activité du principe actif majoritaire de G. sempervirens, la gelsémine, qui est une molécule bien caractérisée par les chimistes mais n’ayant fait l’objet d’aucune étude sérieuse en biologie fondamentale. Ainsi, dans un premier temps, nous avons recherché les effets de la gelsémine synthétique sur la production de 3α,5α-THP dans la moelle épinière (ME) qui joue un rôle crucial dans la nociception. Cette première partie du travail a permis de maîtriser l’ensemble des paramètres pharmacologiques, de caractériser le récepteur impliqué dans la médiation de l’effet de la gelsémine et de déterminer son mode d’action. L’analogie structurale de la gelsémine avec la strychnine, un antagoniste sélectif des récepteurs glycinergiques (Gly-Rs), nous a permis d’intégrer l’analyse de l’effet de la gelsémine sur la biosynthèse de 3α,5α-THP dans le cadre des interactions entre les modulateurs du système glycinergique et la neurostéroïdogenèse. Grâce à la combinaison des techniques de pulse-chase, d’HPLC et de détection radioactive en flux continu (Flo/One), nous avons montré que la glycine (1 à 140 μM) et la gelsémine (10-10 à 10-6 M) stimulent de façon dose-dépendante la biosynthèse de 3α,5α-THP dans la ME. La strychnine à 10-5 M, qui n’induit d’elle-même aucune modification de la neurostéroïdogenèse, bloque complètement l’effet stimulateur de la glycine ou de la gelsémine, ce qui démontre l’implication des Gly-Rs dans la médiation de l’action de la glycine ou de la gelsémine sur la biosynthèse de 3α,5α-THP dans la ME. En nous appuyant sur les conditions expérimentales établies avec la molécule de synthèse (la gelsémine), nous avons comparé les effets des dilutions homéopathiques de gelsémine et G. sempervirens sur la production de 3α,5α-THP dans la ME et dans le système limbique qui contrôlent respectivement la douleur et l’anxiété. Parmi les dilutions testées dans un intervalle de 5 CH (10-10 M en utilisant le nombre de moles de gelsémine comme référence) à 15 CH (10-30 M), seules les dilutions 5 CH et 9 CH de G. sempervirens ou de gelsémine sont efficaces pour stimuler la biosynthèse de 3α,5α-THP dans la ME et le système limbique. Le pourcentage de stimulation de la production de 3α,5α-THP induit par G. sempervirens est plus important que celui obtenu avec la gelsémine, suggérant l’existence d’une synergie positive entre la gelsémine et d’autres constituants de G. sempervirens. L’effet stimulateur de G. sempervirens ou de gelsémine à 5 CH est également bloqué par la strychnine, indiquant que les Gly-Rs restent impliqués dans les mécanismes d’action de ces substances même lorsque les dilutions sont réalisées par le mode homéopathique. Dans la dernière partie de la thèse, nous avons complété les résultats des expériences in vitro par des analyses in vivo qui nous ont permis de nous assurer que des modifications de l’activité de la 3α- hydroxystéroïde oxydo-réductase ou 3α-HSOR (enzyme clef synthétisant la 3α,5α-THP) dans la ME se répercutent effectivement sur la sensibilité à la douleur. Des expériences de PCR quantitative en temps réel, de Western blot, de pulse-chase et d’HPLC-Flo/One ont révélé qu’en situation de douleur neuropathique (induite par ligature du nerf sciatique), les niveaux d’ARNm ou de protéine 3α-HSOR ne varient pas dans la ME mais l’activité enzymatique s’accélère pour entraîner une surproduction de 3α,5α-THP endogène. L’action antalgique de la 3α,5α-THP endogène a été mise en évidence par des injections intrathécales et des tests comportementaux utilisant les filaments de von Frey (sensibilité mécanique) et la méthode de Hargreaves (sensibilité thermique). La Provera (composé inhibiteur de l’activité 3α-HSOR) induit un effet pro-nociceptif et aggrave les symptômes de la douleur neuropathique alors que la 3α,5α-THP supprime ces symptômes en exerçant une action antalgique. Ces résultats, qui démontrent que l’augmentation de la concentration spinale de 3α,5α-THP in vivo atténue effectivement la douleur, posent les bases pour des travaux ultérieurs qui analyseront également in vivo le lien direct entre les probables effets antalgiques ou anxiolytiques de G. sempervirens et son action stimulatrice de la biosynthèse de 3α,5α-THP dans la ME et le système limbique. Nos travaux ouvrent des perspectives intéressantes pour l’élaboration de thérapies efficaces avec la gelsémine ou G. sempervirens à 5 CH et 9 CH qui sont des dilutions conservant des caractéristiques pharmacologiques précises (nombre de moles, activation des Gly-Rs et stimulation de la biosynthèse de 3α,5α-THP), dénuées d’actions indésirables et susceptibles d’induire in vivo des effets bénéfiquesThe nervous tissue is capable of producing bioactive steroids or neurosteroids which control various neurophysiological processes. Several investigations have shown that neurosteroid allopregnanolone (3α,5α-THP), a potent activator of neuroinhibition, efficiently modulates nociception and anxiety by acting through paracrine and/or autocrine modes. Therefore, has emerged in the literature, an idea suggesting that substances exhibiting a stimulatory effect on 3α,5α-THP production in the central nervous system may potentially be interesting for the development of strategies against anxiety and pain. However, to be therapeutically effective, the candidate substances must be devoid of side effects such as nausea, dependence or breathing failure induced by most of the currently available anxiolytics and analgesics. For several years, homeopathic preparations of Gelsemium sempervirens (G. sempervirens) are advertised by the company BOIRON as anxiolytic and analgesic medicines devoid of adverse effects but, surprisingly, scientific results from basic research supporting this assertion are rare. In particular, cellular and pharmacological mechanisms of action of G. sempervirens are completely unknown. In our endeavor to clarify this ambiguous situation, we found important to investigate in a first step the cellular activity of gelsemine, the major active principle in G. sempervirens composition. Indeed, the chemical structure of the alkaloid gelsemine has been extensively studied but its cellular or biological effects remain so far unexplored. Thus, we investigated the action of gelsemine on 3α,5α-THP biosynthesis in the rat spinal cord (SC), a pivotal structure controlling nociception. This study allowed the characterization of pharmacological features of gelsemine including the receptor mediating its effect and related mechanism of action. The high structural analogy between gelsemine and another alkaloid, strychnine, a selective antagonist of glycinergic receptors (Gly-Rs), led us to investigate gelsemine effect on 3α,5α-THP production within the context of key interactions between glycinergic system and neurosteroidogenesis which determine the central inhibitory transmission. Thanks to the well-validated approach combining pulse-chase experiments, HPLC and flow scintillation detection (Flo/One), we observed that glycine (1 − 140 μM) and gelsemine (10-10 − 10-6 M) stimulated dose-dependently 3α,5α-THP biosynthesis in the SC. Strychnine (10-5 M), which did not modify by itself neurosteroid formation, completely blocked the stimulatory effect induced by glycine or gelsemine, indicating that Gly-Rs are involved in the mediation of glycine and gelsemine effects on 3α,5α-THP production. Based upon the strict experimental conditions established with the synthetic compound gelsemine, we compared the effects of homeopathic dilutions of G. sempervirens and gelsemine on 3α,5α-THP formation in the SC and limbic system which control pain transmission and anxiety, respectively. Gelsemine and G. sempervirens were tested within a dilution range from 5 to 15 CH (10-10 − 10-30 M in terms of quantity of gelsemine). Two dilutions of G. sempervirens or gelsemine, 5 CH and 9 CH, were able to stimulate 3α,5α-THP neosynthesis in the SC and limbic system. The stimulatory action of G. sempervirens was higher than that of gelsemine, suggesting a positive synergism between gelsemine and other constituents of G. sempervirens. Strychnine antagonized also the effect of G. sempervirens or gelsemine at 5 CH, indicating that Gly-Rs remain involved in their mechanisms of action independently from the homeopathic dilution mode. To check whether changes of 3α-hydroxysteroid oxido-reductase or 3α-HSOR bioactivity (crucial for 3α,5α-THP biosynthesis) in the SC may effectively affect pain sensitivity, various analyses were performed in vivo to complete the data obtained in vitro. In rats subjected to sciatic nerve injury-evoked neuropathic pain, quantitative real time PCR, Western blot, pulse-chase and HPLC-Flo/One analyses revealed an up-regulation of 3α-HSOR activity which increased 3α,5α-THP production in the SC. Intrathecal injection of Provera (3α-HSOR inhibitor) induced a pro-nociceptive effect in naive animals and exacerbated, in neuropathic rats, pain symptoms assessed with the Hargreaves behavioral method and von Frey filament test. In contrast, enhancement of 3α,5α-THP concentration in the SC using intrathecal injection induced analgesic or anti-nociceptive effects in neuropathic or naive rats, respectively. These results constitute an important background for future investigations aiming to establish in vivo the direct link between G. sempervirens anxiolytic or analgesic effect and its stimulatory action on 3α,5α-THP formation in the SC and limbic system. Altogether, our data open new possibilities for the development of effective therapies with gelsemine and G. sempervirens at 5 CH and 9 CH which are two dilutions exhibiting well-defined pharmacological features, presumably devoid of adverse effects and capable of modulating key neurophysiological functions