Synthesis and evalution of oligonucleotide-polymine conjugates

Ce travail porte sur la synthèse et l’évaluation d’oligonucléotides conjugués à des polyamines. Dans un premier temps, une polyamine naturelle, la spermine a été couplée répétitivement à l’extrémité 3’ d’un oligonucléotide grâce à une nouvelle stratégie de conjugaison : la formation d’une liaison guanidine inter spermines. Jusqu’à 3 résidus polyaminés ont ainsi été ajoutés à un décamère. Ces conjugués présentent une affinité améliorée pour des oligonucléotides de séquences complémentaires. Toutefois, leur synthèse demande à être perfectionnée pour obtenir des composés de charge globale cationique. Dans un deuxième temps, des oligonucléotides antisens présentant un squelette modifié 2’ OMe phosphorothioate ont été couplés en 5’ à des spermines par la chimie des phosphoramidites. Ces oligonucléotides, cationiques, ont montré une internalisation cellulaire sans agent de transfection et une efficacité biologique sur un modèle in vitro de correction de l’épissage alternatif. Enfin, des siRNAs cationiques ont été synthétisés et conjugués à des résidus lipidiques. Ces parties lipophiles servent « d’ancres » pour pré associer les siRNAs avec une protéine sérique, l’albumine, afin de les protéger in vivo de la dégradation par les nucléases. Leur capacité à se présenter sous forme de molécules isolées ou à s’auto assembler, et leur interaction avec l’albumine ont été caractérisées par microscopie électronique en transmission. Ces siRNAs sont capables d’éteindre l’expression d’un gène (ca 90%) in vitro sans agent de transfection, y compris en présence de sérum. Leur pré association avec l’albumine n’affecte en rien leur efficacité.This work consists in synthesis and evaluation of oligonucleotides polyamines conjugates. First, a natural polyamine, the spermine, was repetitively coupled to the 3’ end of an oligonucleotide through novel conjugation chemistry, resulting in the formation of a guanidine inter spermine link. Up to three spermine residues could thus be appended to a decamer. Such conjugates exhibited increased affinity for their target sequence. However, synthetic improvements are required in order to obtain oligonucleotides with an overall cationic charge. Subsequently, antisense oligonucleotides bearing a 2’ OMe phosphorothioate modified backbones were coupled to polyspermines at their 5’end, through phosphoramidite chemistry. Those cationic oligonucleotides showed carrier free cell transfection potency and efficient splicing correction in an in vitro model. Finally, cationic siRNAs were synthesized and conjugated to lipidic moieties. Lipophilic blocks would serve as “anchors” to pre load those siRNAs on seric protein albumin, to protect them in vivo from nuclease degradation. Ability of such conjugates to exist at a single molecule state or to self assemble as well as their interaction with albumin were characterized by Transmission Electron Microscopy (TEM). Lipophilic siRNas were able to induce gene silencing (ca 90%) without the use of any transfection agent, even in presence of serum. Preloading them on albumin did not impair their biological efficiency