Etudes structurales d'une RNase P protéique d'Arabidopsis thaliana

La maturation des ARNt en 5' est réalisée par RNase P. C'est un ribozyme chez les bactéries, les fungi et les nuclei des mammifères et un enzyme protéique dans les plantes ou des organelles des mammifères qui s’appelle PRORP. Il y a trois PRORP dans A. thaliana. PRORP contiennent deux domaines : un domaine PPR qui reconnaît spécifiquement des séquences d'ARN et un domaine nucléase qui assure la coupure endonucléolytique 5' des précurseurs d’ARNt. Pendant ma thèse j'ai pu montré par des méthodes biophysiques et structurales comme SRCD et SAXS que PRORP1 et 2 sont composées en majorité des hélices alpha Elles ont un rayon de giration de 33 Å et contiennent deux domaines distincts avec et une dimension maximale de 110 Å. Pour le complex entre un substrat d'ARNt et PRORP une constante de dissociation de 1 uM a pu être confirmé par la microcalorimétrie, la thermophorèse et l'ultracentrifugation analytique. Ces analyses nous ont permis de construire un modèle PRORP et un substrat d'ARNt.RNase P cleaves 5’ leaders of precursor tRNAs. RNase P is a ribozyme in bacteria, fungi and animal nuclei and a protein in animal organelles, plants and many other organism. There are three PRORPs in A. thaliana. MALS, SRCD and SAXS provided first structural information: 1) PRORPs are monomers in solution. 2) PRORP 1-2 have a high alpha-helical content. 3) PRORPs are composed of two distinct domains with a radius of gyration of 33 A. These results together with homology modelling enabled us to build a first model of PRORPs in complex with tRNA. Using three different methods, isothermal titration calorimetry, microscale thermophoresis and analytical ultracentrifugation, a binding constant of about 1 µM could be determined for the system PRORP2mDD and L5T0 tRNA. This helped us conducting a SAXS experiment taking into account the low resolution affinity and designed to provide the direct structural data of a complex of proteinaceous RNase P with a substrate tRNA