Potencial de bacteriófagos y proteínas fágicas para la eliminación de biofilms formados por estafilococos

Tesis con mención internacional. Tesis doctoral por el sistema de compendio de publicacionesLa capacidad que tienen algunas bacterias para formar biofilms sobre determinadas superficies dificulta la eliminación de las mismas, y causa graves problemas sanitarios. Bacterias formadoras de biofilms como Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis tienen especial relevancia en clínica por ser causantes de infecciones nosocomiales. S. aureus está implicado además en intoxicaciones alimentarias. En este contexto, esta Tesis plantea el estudio de la capacidad de bacteriófagos y proteínas fágicas para eliminar biofilms formados por estafilococos. Nuestros resultados confirman que los sistemas actuales de limpieza e higienización de la industria alimentaria no son suficientes para eliminar S. aureus, el cual se detectó en un 6.11% de muestras de superficies de industrias láctea, cárnica y pesquera. Estas cepas son potencialmente patógenas al poseer la capacidad de producir enterotoxinas, portar elementos genéticos móviles y los genes necesarios para formar biofilms. El estudio de la microbiota acompañante de S. aureus en estos biofilms mostró la presencia de otras bacterias patógenas y alterantes, lo que aumenta el riesgo de contaminación de los alimentos. El aislamiento y caracterización de nuevos bacteriófagos capaces de infectar eficazmente cepas de Staphylococcus constituye una alternativa prometedora a los antimicrobianos de uso habitual. Por ello, se caracterizaron dos fagos, vB_SauM-phiIPLA-RODI y vB_SepM-phiIPLA-C1C, de la familia Myoviridae que poseen un amplio rango de huésped (infectan gran número de cepas de Staphylococcus). Su capacidad bactericida permite la eliminación total de bacterias en estado planctónico tras 6 h de incubación. Asimismo, reducen el número de bacterias viables y eliminan el 75% de la biomasa total de biofilms maduros formados por S. aureus, S. epidermidis o por una mezcla de ambas especies. La caracterización de bacteriófagos se extendió a tres fagos (vB_SepiS-phiIPLA5, vB_SepiS-phiIPLA6 y vB_SepiS-phiIPLA7) de la familia Siphoviridae que infectan exclusivamente a S. epidermidis. La capacidad bactericida del fago virulento phi-IPLA5 frente a bacterias en estado planctónico fue superior incluso a la de la mezcla de los otros dos fagos, que sólo provocó una reducción de 2,2 unidades logarítmicas. Los fagos phi-IPLA5 y phi-IPLA7 codifican una proteína con actividad exopolisacárido depolimerasa (Dpo7), que posee un dominio pectín liasa. Su actividad frente a biofilms polisacarídicos formados por Staphylococcus redujo el 75% de la biomasa total, lo que confirma que su sustrato es el exopolisacárido. Adicionalmente, se evaluó el potencial de la endolisina fágica LysH5, para eliminar biofilms formados por Staphylococcus, observándose una reducción de 3 unidades logarítmicas, siendo necesarios dos tratamientos para la eliminación total de las bacterias. LysH5 posee además actividad lítica frente bacterias ¿persisters¿ tolerantes a los antibióticos. Por otro lado, se evaluó el potencial de mezclas fágicas para eliminar cepas de S. aureus de distintos orígenes. La mayoría de las cepas eran sensibles al fago K (Myoviridae) y al fago ¿CAPSa1 (Siphoviridae) independientemente de cuál fuese su origen. Sin embargo, los fagos ¿H5 y ¿A72 (Siphoviridae) mostraron preferencia por cepas de origen lácteo. Este restringido rango de huésped parece estar relacionado con una notable dispersión de profagos similares a ¿H5 y ¿A72 en las cepas analizadas. Asimismo, cabe señalar la utilidad de la técnica RAPD-PCR optimizada para estudiar de forma rápida la variabilidad genética de los fagos y facilitar su proceso de selección. El método permite obtener patrones genéticos únicos y reproducibles para cada fago. Finalmente, se realizó un trabajo de clasificación de aquellos fagos pertenecientes a la familia Siphoviridae que infectan Staphylococcus, estableciéndose tres nuevos géneros ¿3alikevirus¿, ¿77likevirus¿ y ¿Phietalikevirus¿, con claras diferencias en sus secuencias nucleotídicas y en la presencia/ausencia de proteínas específicas, como las que tienen actividad peptidoglicano hidrolasa y las implicadas en el empaquetamiento y procesamiento del ADN