Peptidoglicano hidrolasas del bacteriógrafo vB_SauS-philPLA88 y su actividad antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus

El desarrollo de microorganismos indeseables en los alimentos provoca grandes pérdidas económicas en la industria alimentaria, además de representar un riesgo para la salud de los consumidores. Entre estos microorganismos se encuentra Staphylococcus aureus, uno de los principales agentes causantes de gastroenteritis en la población mundial, debido a su capacidad para formar enterotoxinas resistentes a los tratamientos térmicos, a los ácidos del estómago y a las proteasas. La presencia en los alimentos de este patógeno puede deberse a la contaminación de la materia prima, que en el caso de la leche puede producirse en el momento del ordeño, ya que esta bacteria es causante de mastitis en el ganado vacuno. En otras ocasiones, la contaminación se produce durante el proceso de producción, debido a los manipuladores de alimentos o a una falta de higiene en las instalaciones de la industria alimentaria. Son necesarias pues, medidas que garanticen la calidad higiénico-sanitaria de los alimentos pero que, a la vez, respondan a las demandas de un consumidor cada vez más exigente, que prefiere alimentos mínimamente procesados, con menor carga de aditivos de síntesis química, y cuya producción sea respetuosa con el medio ambiente. En este contexto, el objetivo global de esta Tesis ha sido el estudio de proteínas líticas de origen fágico como antimicrobianos frente a S. aureus, para su posible uso como bioconservantes en productos lácteos. Los resultados obtenidos revelaron que el fago vB_SauS-phiIPLA88 (phi-IPLA88), derivado lítico del fago ¿H5 aislado del ambiente lácteo, posee una proteína estructural con capacidad degradadora de peptidoglicano, la cual presenta homología con otras proteínas líticas de origen fágico. Su caracterización enzimática mostró que HydH5 es capaz de lisar células vivas de S. aureus, lo que le confiere un gran potencial como antimicrobiano. Por ello, decidimos mejorar su actividad mediante la construcción de proteínas quimera formadas por diferentes combinaciones de dominios entre HydH5 y la lisostafina, bacteriocina específica frente a S. aureus. Todas ellas mostraron mayor actividad que HydH5 y un espectro de acción más amplio. El análisis de los sitios de corte en el peptidoglicano por espectrometría de masas confirmó que todos los dominios son activos en cada una de las proteínas, lo cual permitió corroborar la hipótesis de que la presencia de dos o más dominios catalíticos activos en las proteínas fágicas disminuye la probabilidad de aparición de resistencia bacteriana a dichas proteínas. Por otra parte, las propiedades antimicrobianas de las proteínas fágicas estudiadas han impulsado el estudio de otros aspectos interesantes de cara a su utilización a nivel industrial. Uno de ellos es la producción y purificación de las proteínas para su aplicación posterior como bioconservante alimentario. Así, hemos clonado en Lactococcus lactis el gen que codifica la endolisina LysH5 del fago phi-IPLA88. La fusión de dicha proteína a un péptido señal permitió la expresión y secreción de la proteína activa en un sistema GRAS. Otro aspecto importante abordado es la combinación de estos nuevos antimicrobianos con otros conservantes, con la intención de obtener un efecto sinérgico que pudiera disminuir la dosis efectiva, y abaratar así el coste de su utilización. Para ello, se han utilizado mezclas de la endolisina LysH5 con la bacteriocina nisina frente a S. aureus en leche, demostrando que una pequeña cantidad de nisina es capaz de disminuir la dosis efectiva de LysH5 unas 10 veces. Finalmente, se abordó el estudio de la actividad y estabilidad de las proteínas fágicas en leche sometida a diferentes condiciones de procesamiento. Nuestros resultados indicaron que la proteína quimera CHAPSH3b es capaz de reducir el número de viables de S. aureus, tanto a temperatura ambiente como a 37ºC, en leche cruda y en leche procesada térmicamente. Además, observamos que esta proteína presenta una gran estabilidad térmica, soportando el proceso de pasteurización de la leche y las condiciones de refrigeración. Estas características hacen de la proteína CHAPSH3b un buen candidato para evitar tanto contaminaciones por S. aureus que se produjeran con posterioridad al tratamiento térmico, como su crecimiento durante una eventual rotura de la cadena de frío. Por otra parte, la caracterización de un mutante del bacteriófago ¿11 carente de su peptidoglicano hidrolasa estructural, permitió demostrar que las peptidoglicano hidrolasas estructurales no son esenciales para el proceso de infección, postulando su posible implicación en la eyección del material genético del fago tras el reconocimiento del hospedador adecuado