Regulation of murine hepatic <em>Cytochrome P450 2a5</em> expression by transcription factor Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2

Abstract The hepatic inducible Cytochrome P450s (CYPs) generally prime xenobiotics for elimination. Murine CYP2A5 and human CYP2A6 share similar xenobiotic substrates and some regulatory features. Recently, they were shown to oxidize bilirubin, a byproduct of heme catabolism and a dose-dependent anti- or pro-oxidant, to biliverdin. In this study, the putative role of the redox-sensitive, cytoprotective transcription factor Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) in the regulation of hepatic Cyp2a5 expression and induction under diverse hepatotoxic conditions and altered heme homeostasis was characterized. The coordination of Cyp2a5 and the Nrf2 target gene Heme oxygenase-1 (Hmox1), which determines bilirubin formation from heme, responses to heavy metals and modulators of heme homeostasis, was studied in cultured wildtype and Nrf2(-/-) mouse primary hepatocytes. Nrf2 was essential for the basal hepatic expression of CYP2A5 in the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria, as well as for its induction by cadmium, lead, methyl mercury and phenethyl isothiocyanate. A functional Nrf2 binding antioxidant response element (ARE) about -2.4 kilobases upstream of the Cyp2a5 transcriptional start site was identified. In contrast to Hmox1, a target of BTB and CNC homology 1 (Bach)-mediated repression via AREs, the regulation of Cyp2a5 did not clearly involve Bach1. Excessive heme induced mainly ER-localized CYP2A5 via Nrf2, which was limited by the Nrf2-independent HMOX1 induction. In heme synthesis blockades, CYP2A5 was enhanced via Nrf2 and additional factors, such as the peroxisome proliferator-activated receptor &#947; coactivator-1&#945; (PGC-1&#945;). The typical CYP2A5 inducers phenobarbital, dibutyryl-cyclic adenosine monophosphate (db-cAMP) and PGC-1&#945; enhance heme synthesis; CYP2A5 was induced via Nrf2 in acute but not chronic phenobarbital exposure without a clear connection to heme, while the responses to db-cAMP and PGC-1&#945; were sensitized in the absence of Nrf2. This suggests novel crosstalk between Nrf2 and PGC-1&#945;. In this study, Cyp2a5 was identified as a sensitive indicator of hepatic Nrf2 pathway activation that could be used, e.g. for in vitro screening of drug candidate hepatotoxicity. The similar subcellular localization and coordination of CYP2A5 and HMOX1 expression in altered heme metabolism support the postulated role for CYP2A5 in bilirubin homeostasis.Tiivistelmä Vierasaineet stimuloivat maksan Sytokromi P450 (CYP)-entsyymejä, mikä yleensä lisää niiden eliminaatiota. Hiiren CYP2A5 ja ihmisen CYP2A6 ovat lähisukua katalyyttisten ja osin säätelyllisten yhteneväisyyksiensä puolesta. Vastikään niiden osoitettiin katalysoivan hemin hajoamistuotteen, bilirubiinin hapettumista biliverdiiniksi, mikä saattaisi säädellä sen annosriippuvaisia vaikutuksia antioksidanttina ja oksidanttina. Työssä tutkittiin solustressiä aistivan, suojaavan transkriptiotekijän Nrf2 osuutta Cyp2a5-geenin aktivaatiossa maksatoksisissa olosuhteissa ja hemimetabolian muutoksissa. Cyp2a5:n ja bilirubiinin tuotosta vastaavan, Nrf2-säädellyn Hemioksigenaasi-1 (Hmox1):n vasteita verrattiin viljellyissä villityypin ja poistogeenisen Nrf2(-/-) hiiren primaarimaksasoluissa. Tulokset osoittavat, että Nrf2 ylläpitää CYP2A5:n ilmentymistä endoplasmisella kalvostolla (ER) ja mitokondrioissa sekä välittää sen stimulaation altisteilla kadmium, lyijy, metyylielohopea ja fenetyyli-isotiosyanaatti. Toimiva Nrf2-vasteinen antioksidanttivaste-elementti (ARE) tunnistettiin n. -2,4 kiloemäsparia Cyp2a5-geenin luennan aloituskohdasta ylävirtaan. BTB ja CNC homologia 1 (Bach1)-tekijä, joka on tärkeä Hmox1-säätelijä ja ARE-välitteinen transkription estäjä, ei selkeästi osallistu Cyp2a5:n säätelyyn. Hemin ylimäärä stimuloi CYP2A5:n määrää ER-kalvostolla, Nrf2-riippumattomasti stimuloituvan HMOX1 rajoittaessa Nrf2-reitin aktivaatiota. Hemisynteesin estyessä Nrf2 aktivoi Cyp2a5-geeniä muiden mekanismien kuten peroksisomiproliferaattori-aktivoituva reseptori gamman koaktivaattori-1&#945; (PGC-1&#945;) kanssa. Fenobarbitaali (PB), dibutyryyli-syklinen adenosiinimonofosfaatti (db-cAMP) ja PGC-1&#945; lisäävät tunnetusti hemisynteesiä. Nrf2 havaittiin Cyp2a5:n aktivaatiolle välttämättömäksi akuutissa mutta ei kroonisessa PB-altistuksessa ilman selkeästi havaittua hemin osuutta. Cyp2a5-geenin db-cAMP- ja PGC-1&#945;-vasteinen stimulaatio voimistui merkittävästi toimivan Nrf2-reitin puuttuessa, mikä osoittaa vuoropuhelua Nrf2 ja PGC-1&#945; välillä. Väitöskirjatyössä Cyp2a5 tunnistettiin herkäksi Nrf2-reitin aktivaation maksamarkkeriksi, jota voitaisiin hyödyntää esim. lääkeainekandidaattien maksatoksisuuden seulonnassa soluviljelyssä. CYP2A5:n ja HMOX1:n solunsisäinen kohdentuminen ja ekspressio koordinoituvat hemimetabolian muutoksissa, mikä tukee teoriaa CYP2A5:n roolista bilirubiinin metaboliassa maksassa