Isolation and characterization of mutants of Trichoderma harzianum strain ITEM 908 tolerant to antifungal metabolites of Fusarium oxysporum

La lotta biologica mediante l’impiego di funghi antagonisti è un utile mezzo di difesa delle colture agrarie da agenti fitopatogeni fungini. Il fungo antagonista Trichoderma harzianum viene impiegato efficacemente per contrastare l’azione di funghi fitopatogeni terricoli come Pythium spp., Sclerotinia spp. e Rhizoctonia spp. Risultati meno soddisfacenti si sono avuti nel controllo di Fusarium oxysporum ff.sp. Ciò è dovuto alle forti attitudini competitive di F. oxysporum che, almeno in parte, dipendono dalla produzione di sostanze antimicrobiche che assicurano al fungo un vantaggio competitivo nell’ambito delle biocenosi del terreno. Obiettivo di questo lavoro di tesi è stato il miglioramento della tolleranza dell’isolato T. harzianum ITEM 908 (Th908) all’azione di metaboliti antifungini di F. oxysporum. Ciò al fine di I) migliorare le prestazioni antagonistiche del ceppo Th908 nei confronti di forme fitopatogene di F. oxysporum e II) rendere possibile l’uso combinato del ceppo Th908 con ceppi di F. oxysporum non patogeni per colture agrarie e utilizzati come agenti di biocontrollo. E’ stata investigata la produzione di metaboliti bioattivi da parte di due isolati di F. oxysporum, di cui uno fitopatogeno (Fo2797) e l’altro impiegato come micoerbicida (FoFT2), mediante TLC e HPLC. L’acido fusarico (AF) e il suo analogo acido 9,10-deidrofusarico (ADF) sono stati identificati come i principali metaboliti bioattivi di entrambi gli isolati (Fo2797:AF=46 mg/ml, ADF=151 mg/ml;FoFT2: AF=51 mg/ml, ADF=34 mg/ml). Sia l’AF che gli estratti organici dei brodi colturali di Fo2797 e FoFT2 mostravano una forte attività d’inibizione verso Th908. L’attività antifungina di AF, generalmente considerata una fitotossina, è qui riportata per la prima volta. Allo scopo di generare mutanti di Th908 migliorati nella tolleranza ai metaboliti antifungini di Fo2797 e FoFT2, conidi di Th908 sono stati esposti a irraggiamento con UV-C. La sucessiva selezione, condotta su oltre 300 mutanti utilizzando substrati arricchiti con AF o estratti colturali di FoFT2, ha consentito di selezionare due mutanti (Th908-5 e Th908-81) dotati di migliorata resistenza ai metaboliti bioattivi e la cui mutazione è risultata stabile nel tempo. Successive indagini di tipo eco-fisiologico hanno escluso variazioni peggiorative di importanti caratteristiche, quali la competenza per la rizosfera e la capacità di diffusione nel terreno, rispetto al ceppo selvatico (Th908-wt). I nuovi biotipi mostravano inoltre una maggiore competitività nei confronti degli isolati di F. oxysporum in colture duali. Quando saggiati in vivo su germinelli di pomodoro, il mutante Th908-5 è risultato più efficace di Th908-wt e del mutante Th908-81 nel contrastare l’effetto patogenico di Fo2797, riducendo del 40% (p<0,05) la mortalita delle piantine causata da Fo2797. Inoltre, l’azione di Th908-5 non è stata ridotta da FoFT2, dimostrando la compatibilità dei due funghi. Infine, è stata indagata la base genetica della resistenza acquisita dai nuovi biotipi attraverso l’analisi dell’espressione di 5 geni, codificanti proteine transmembrana potenzialmente coinvolte nella polichemioresistenza (MDR) di T. harzianum, mediante RT-PCR. In risposta all’AF, il gene putativamente codificante la proteina Multidrug resistance protein B è risultato espresso in maniera differenziale nei due mutanti, permettendo così di ipotizzare una possibile implicazione in tale fenomeno.The use of fungal antagonists is regarded as an effective mean of control of soil-borne plant pathogens. Trichoderma harzianum is a well-known fungal antagonist that has been shown to be an effective biological control agent (BCA) against Pythium spp., Sclerotinia spp., Rhizoctonia spp. and Fusarium spp. The biological control of Fusarium oxysporum ff. spp. by T. harzianum has been less successful. Probably, this is due to the highly competitive nature of F. oxysporum, at least in part related to the production of antimicrobial compounds used as weapons within the soil microbial consortium. The aim of this work was to improve the tolerance of the antagonistic strain T. harzianum ITEM 908 (Th908) to antifungal metabolites produced by F. oxysporum, in order to I) improve the antagonistic performance of Th908 against phytopathogenic F. oxysporum strains; II) enhance the compatibility between Th908 and non pathogenic strains of F. oxysporum used as BCA. The production of bioactive metabolites by two F. oxysporum strains, a phytopathogenic strain (Fo2797) and a mycoherbicidal strain (FoFT2), was investigated by TLC and HPLC. Fusaric acid (FA) and its analogous 9,10-Dehydrofusaric Acid (DHFA) were identified as the major bioactive compounds produced by the analysed strains (Fo2797:AF=46 mg/ml, ADF=151 mg/ml;FoFT2: AF=51 mg/ml, ADF=34 mg/ml). Both FA and culture extracts of Fo2797 and FoFT2 showed a strong inhibitory effect towards Th908. This is the first report of the antifungal activity of FA. In order to generate mutants of Th908 resistant to antifungal metabolites of Fo2797 and FoFT2, a UV-mutagenesis strategy was used. Among 300 presumptive UV-C mutants isolated, two mutants (Th908-5 e Th908-81), which bore stable mutation, were resistant to AF and FoFT2 organic extracts. Further, eco-physiological investigations did not show any detrimental effects of mutation with regard to rhizosphere competence and soil colonization capability of the new biotypes, compared to the wild type strain (Th908-wt). In addition, in dual culture assays both mutants were more competitive than Th908-wt to F. oxysporum. When tested in vivo on tomato germlings, Th908-5 showed a greater biocontrol efficacy than Th908-wt and Th908-81. Th908-5 was able to reduce by 40% (p