Meccanismi cellulari ed aree cerebrali coinvolti nella mediazione degli effetti ansiolitici dei cannabinoidi.

L’ansia può essere considerata come una risposta emotiva fisiologica e una componente adattativa della risposta allo stress fornita dall’organismo in seguito ad una situazione critica. Uno stato d’ansia temporaneo e proporzionale alla situazione che lo provoca è considerato una reazione di difesa dell’organismo, tuttavia l’ansia eccessiva per cronicità o intensità può essere socialmente lesiva e creare stati di malattia. Il ruolo dei cannabinoidi nella regolazione degli stati d’ansia è ancora controverso. Dalla letteratura, però emerge come la cannabis possa produrre, negli umani, rilassamento, euforia oppure ansia e attacchi di panico a seconda del soggetto. Allo stesso modo animali trattati con diversi agonisti cannabici, manifestano comportamenti ansiolitici o ansiogenici a seconda della dose somministrata. Alla base della regolazione degli stati ansiosi sembra esserci un complesso circuito neuronale, che se alterato può provocare l’insorgenza di uno stato d’ansia: oltre al sistema ipotalamo-ipofisi-surrenale e ai sistemi GABAergico, serotoninergico e noradrenergico, sembrano essere coinvolti molti altri neurotrasmettitori e neuromodulatori; in particolare c’è un interesse sempre crescente nei confronti del sistema degli endocannabinoidi. Diverse osservazioni supportano infatti un ruolo degli endocannabinoidi nella modulazione degli stati ansiosi: la localizzazione dei recettori CB1 in aree cerebrali quali la corteccia frontale, l’ippocampo, il nucleus accumbens, l’amigdala, oltre che la modulazione da parte degli endocannabinoidi del rilascio di numerosi neurotrasmettitori implicati nel controllo degli stati ansiosi. Recentemente è stato dimostrato che nel ratto la somministrazione periferica del composto URB597, un inibitore selettivo dell’enzima degradativi dell’anandamide, la FAAH (fatty acid amide hydrolase), produce un significativo effetto ansiolitico, suggerendo che elevati livelli di endocannabinoidi, e in particolare di anandamide, esercitano un effetto ansiolitico CB1 dipendente (bloccato dall’SR141716A). Nella presente tesi sono stati sviluppati tre punti fondamentali: l’individuazione delle aree maggiormente coinvolte nella mediazione degli effetti ansiolitici/ansiogenici dei cannabinoidi; l’identificazione dei cammini cellulari coinvolti negli affetti ansiolitici/ansiogenici dei cannabinoidi e lo studio del ruolo del tono endogeno nella modulazione dell’ansia. Per prima cosa abbiamo indagato l’effetto di basse dosi di THC somministrato intraperitonealmente sul comportamento ansioso di ratti maschi usando l’Elevated Plus Maze (EPM). Abbiamo osservato un effetto ansiolitico in un range di dosi tra 0.075 e 1.5 mg/Kg e la dose 0.75 è risultata essere la più efficace. Un pre-trattamento con AM251 (antagonista del recettore CB1), reverte pienamente gli effetti del THC, suggerendo un coinvolgimento dei recettori CB1. Successivamente, al fine di chiarire i substrati neuroanatomici che sono alla base della massima dose effettiva di THC, abbiamo indagato l’espressione di cFos nelle regioni cerebrali correlate all’ansia (corteccia prefrontale, nucleus accumbens, amigdala e ippocampo) di ratti esposti all’EPM. Dai nostri risultati è emerso che il THC abbassa significativamente la quantità di cFos in corteccia prefrontale e in amigdala senza avere effetti sulle altre aree cerebrali. Poiché ci sono molte evidenze che CREB regola i comportamenti ansiosi nei ratti, il secondo obiettivo che ci siamo posti è stato quello di valutare la quantità di CREB fosforilato (attivato) nelle stesse aree cerebrali. I ratti trattati con THC mostrano un significativo incremento nella fosforilazione di CREB in corteccia prefrontale e in ippocampo. In corteccia prefrontale questo incremento è legato all’aumento nell’attivazione di ERK, mentre in ippocampo vi è un riduzione nell’attività delle CAMKII ( chinasi con effetto inibitore sull’attivazione di CREB). Tutti questi effetti sono reversati da un pre-trattamento con AM251, suggerendo che la stimolazione dei recettori CB1 è fondamentale nello scatenare tali eventi. Dai nostri risultati emerge perciò che la stimolazione di questi recettori nella corteccia prefrontale, amigdala e ippocampo, con l’attivazione di differenti vie di segnale, è il primo evento alla base degli effetti dei cannabinoidi sugli stati ansiosi. A tale proposito, ulteriore scopo della presente tesi è stato quello di indagare ulteriormente l’effetto della modulazione del tono endocannabico sui comportamenti ansiosi, in particolare studiando le alterazioni dei livelli di endocannabinoidi nella corteccia prefrontale, area cerebrale implicata in molti processi correlati all’ansia e alla paura utilizzando un approccio multidisciplinare. Basse dosi di meta-AEA (l’analogo stabile dell’ AEA) microiniettata in corteccia prefrontale producono una risposta ansiolitica nei ratti mentre dosi più alte inducono a comportamenti più ansiosi. Il pretrattamento con l’antagonista selettivo del recettore CB1 (SR141716) e del TRPV1 (capsazepina) suggerisce che l’effetto ansiolitico dell’AEA potrebbe essere dovuto all’interazione con il recettore cannabico CB1, mentre i recettori vanilloidi sembrano essere coinvolti nell’azione ansiogenica dell’AEA. Manipolando farmacologicamente i contenuti di AEA in corteccia prefrontale microiniettando l’inibitore selettivo della FAAH, URB597, abbiamo osservato una risposta ansiolitica solo a basse dosi e nessun effetto o anche un profilo ansiogenico a dose più elevate. In accordo con questo risultato, drastiche riduzioni nei contenuti di AEA in corteccia prefrontale, ottenuti dall’over-espressione locale della FAAH attraverso la microinieziome del vettore lentivirale, ha prodotto una risposta ansiogenica. Questo dimostra un ruolo ansiolitico per il fisiologico incremento di AEA in corteccia prefrontale, mentre quando i livelli endogeni di AEA sono troppo bassi (mancata attivazione del recettore CB1) o incrementano oltre una certa soglia (stimolazione del TRV1) essi potrebbero portare ad una risposta ansiogenica. In conclusione i risultati ottenuti suggeriscono che gli endocannabinoidi possono svolgere un ruolo chiave nella regolazione degli stati ansiosi, mostrando un effetto bifasico in correlazione con i livelli di anandamide presenti, e indicano un nuovo possibile approccio per le terapie dell’ansia