Aproximación metagenómica para la identificación de enzimas lipolíticas en suelo de busque alto andino del parque nacional natural los nevados

Las Enzimas lipolíticas son carboxil-ester-hidrolasas que rompen los enlaces éster de acilglicéridos mediante la adición de una molécula de agua, dando lugar a ácidos grasos libres y glicerol. Las lipasas se han convertido en uno de los principales biocatalizadores o bioaceleradores con potencial uso bioindustrial y su uso comercial es un negocio multimillonario que comprende una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo la producción de biodiesel, especialidades farmacéuticas, agroquímicos, cosméticos y detergentes entre otros. Como parte de los trabajos que adelanta el Centro Colombiano de Genómica y Bioinformática de Ambientes Extremos GeBiX, relacionados con la exploración metagenómica en el Parque Nacional Natural los Nevados PNN,, en este trabajo de tesis doctoral se propuso realizar la búsqueda de enzimas lipolíticas a través del tamizaje funcional de una biblioteca metagenómica de suelo de bosque alto andino ipara la búsqueda de enzimas lipolíticas. La asignación taxonómica y funcional de las secuencias metagenómicas, reveló que se encuentran relacionadas con secuencias genómicas de bacterias pertenecientes a los phylum Actinobacteria, Proteobacteria y Acidobacteria y en su gran mayoría están comprometidas con el metabolismo de carbohidratos, proteínas, lípidos y con funciones catalíticas como fosfatasa, deshidrogenasa, metiltransferasa y epóxido hidrolasa entre otras. El tamizaje funcional de los 20.000 clones en medio con tributirina, permitió identificar dos clones positivos con base en la formación de halo de hidrólisis alrededor de las colonias. Los clones nombrados como BAA3G2 y BAA3C3 fueron recuperados, el DNA plasmídico extraido y el inserto metagenómico secuenciado. En los dos casos se logró identificar un marco abierto de lectura (ORF) relacionado con la actividad lipolítica. Las enzimas producidas por los dos clones, EstGBX1 y EstGBX2, tienen preferencia por ácidos grasos de cadena corta (C2 y C4) y actividad máxima de 0.142 U / mg a 40 ° C y pH 8.0, y 6,97 U/mg a 60°C y pH 7.0 respectivamente. El análisis filogenético sugiere que las proteínas expresadas por los dos clones, pertenecen a una nueva familia, relacionada con las familias VI y VII de enzimas lipolíticas. Las propiedades bioquímicas de la enzima EstGBX1 y su estructura tridimensional, sugieren que se trata de una enzima novedosa con potencial uso industrial. Los hallazgos derivados de este trabajo, indican que la exploración de ambientes extremos a través del tamizaje funcional de bibliotecas metagenómicas, representa una buena opción para la bioprospección de ecosistemas naturales.Lipolytic enzymes are carboxyl ester hydrolases that break acylglycerides ester bonds through the addition of a water molecule resulting in a free fatty acids and glycerol. Lipases have become in a major biocatalysts with bio-industrial potential. Their commercial use is a multimillion-dollar business that includes a wide variety of applications such as synthesis of biopolymers and biodiesel, the production of pharmaceuticals, agrochemicals and detergents among others. As part of the work done by the Colombian Center for Genomics and Bioinformatics of Extreme Environments GeBix, related to metagenomic exploration at the Nevados National Natural Park PNN, in this doctoral thesis it was proposed the construction and functional screening of a metagenomic library from high andean forest soil, to search for lipolytic enzymes. The Taxonomic and functional assignment of metagenomic sequences present in 1% of the clones revealed that are related with genomic sequences from bacteria belonging to the phylums Actinobacteria, Proteobacteria and Acidobacteria. The vast majority of these sequences are involved with the metabolism of carbohydrates, proteins, lipids and catalytic functions as phosphatase, glycosyltransferase, dehydrogenase, methyltransferase, and epoxide hydrolase dehydratase among others. After functional screening of 20,000 clones, using tributiryn as lipid substrate, two positive clones were identified, based on the formation of hydrolysis halo around the colonies. The clones designated as BAA3G2 and BAA3C3 were recovered, plasmid DNA extracted and the metagenomic inserts sequenced. The size of the inserts was determined at 4.5 and 4.9 Kb respectively and in both cases, it was possible to identify an open reading frame (ORF) related to lipolytic activity. Enzymes produced by the two clones, EstGBX2 EstGBX1, have a preference for short-chain fatty acids (C2 and C4) and maximum activity of 0142 U / mg at 40 ° C at pH 8.0, and 6.97 U / mg at 60 ° C at pH 7.0 respectively. Phylogenetic analysis of the putative lipolytic enzymes from clones BAA3C3 and BAA3G2, suggests that the expressed proteins belongs to a new family of lipolytic enzymes, related to families VI and VII. The biochemical properties of EstGBX1 and its predicted 3D structure, suggest that it is a novel enzyme with potential industrial use. Findings from this study indicate that exploration of extreme environments through the functional screening of metagenomic libraries, irepresents a good choice for bioprospecting of natural ecosystems.Doctor en Ciencias BiológicasDoctorad