Estudio del gen WT1 en la leucemia mieloblástica aguda

En los últimos años se ha producido un notable progreso en la elucidación de la patogénesis molecular de las Leucemias Mieloblásticas Agudas (LMA). Sin embargo, la mayoría de las alteraciones genéticas que subyacen en esta patología son todavía desconocidas. La LMA se caracteriza por la presencia de un “stop madurativo” de las células de la línea mieloide, que escapan de la inhibición de las señales anti-proliferativas y adquieren una capacidad indefinida de auto-renovación. Los posibles mecanismos que pueden explicar el crecimiento incontrolado de las células cancerígenas son la pérdida de función de los genes supresores de tumores y/o la activación de los oncogenes. Aunque ambas son funciones opuestas que en principio deberían ser mutuamente excluyentes en una misma proteína, existen evidencias de que una misma proteína puede mostrar ambas funciones bajo condiciones celulares diferentes. Un ejemplo de ello es el gen del tumor de Wilms (WT1), el cual presenta este tipo de comportamiento dual dependiendo del tipo celular donde se está expresando. El gen WT1 fue originariamente definido como un gen supresor tumoral al encontrarse mutado en un 15% de los tumores de Wilms. Sin embargo, el estudio del papel de WT1 en las células cancerígenas ha revelado un inesperado papel como oncogén. La mayoría de estudios se ha realizado en casos de leucemia donde se ha demostrado la importancia biológica y clínica de WT1 en la supervivencia, diferenciación y proliferación celular. En la presente tesis se ha estudiado a un total de 274 pacientes diagnosticados de LMA de novo en un sólo centro para analizar en profundidad el papel de la expresión total de WT1, la expresión de sus 4 isoformas principales, las variaciones genéticas del gen, tanto mutaciones como el polimorfismo SNP rs16754 y la expresión de los miRNA que podrían estar involucrados en la regulación epigenética de WT1, con el objetivo de elucidar el papel de WT1 en la leucemogénesis. Los resultados de esta tesis muestran una expresión de WT1 total mayor en la leucemia en comparación con su contrapartida sana de células CD34+ de sangre de cordón umbilical, que, además, parece conferir una peor supervivencia a los pacientes que pertenecen al subgrupo FAB M0. En cuanto a las cuatro isoformas principales de WT1, los resultados de esta tesis parecen sugerir que dicha sobreexpresión de WT1 total pueda ser debida a un aumento en la expresión de las isoformas A, B y/o C junto a una disminución relativa de la isoforma D. Además, la mejor supervivencia observada en los pacientes que sobreexpresan la isoforma D hace presuponer que dicha isoforma pueda tener un papel protector en la LMA, aunque este resultado debería ser confirmado con futuros estudios funcionales. Tras el cribado de alteraciones genéticas de WT1 por High Resolution Melting, se encontró la presencia de un 30% de pacientes con la presencia del SNP rs16754 de WT1 en heterocigosis, consistente con lo esperable en la población caucásica. La presencia del alelo menor de dicho SNP no mostró diferencias significativas en términos de supervivencia. Además se detectaron mutaciones del gen WT1 en el 4% de la serie de pacientes, asociándose con un valor pronóstico desfavorable independiente en la serie global. Para averiguar los posible microRNAs potencialmente implicados en la regulación epigenética de WT1 se hibridaron chips de arrrays de miRNA en 10 muestras de pacientes seleccionados en función de su expresión de WT1 total, encontrándose 9 miRNAs con expresión diferencial que fueron validados mediante PCR cuantitativa en la serie de pacientes y controles. Los resultados de la validación sugieren que algunos de los microRNAs estudiados presentan patrones de expresión diferentes a la normalidad pudiendo estar implicados en la regulación de la diferenciación celular. Además, se observó una mejor supervivencia para la infraexpresión de los miR-223, miR-425, miR-500 y miR-1307 en la serie global, aunque no se pudo demostrar su valor pronóstico independiente.In recent years there has been considerable progress in the elucidation of the molecular pathogenesis of the acute Myeloblastic leukemia (AML). However, most of the genetic changes that underlie this disease are still unknown. The AML is characterized by the presence of a maturation stop of the myeloid cell line that escapes from inhibition of anti-proliferative signals and acquire an indefinite self-renewal capacity. The possible mechanisms that may explain the uncontrolled cancer cells growth are the loss of function of the tumor suppressor genes and the activation of oncogenes. Although both are opposing functions that should be mutually exclusive in the same protein, there is evidence that a same protein may show both functions under different cellular conditions. An example of this is the Wilms tumor 1 gene (WT1), presenting this double behavior depending on the cell type where it's expressed. The WT1 gene was originally defined as a suppressor tumor gene based on mutations found in 15% of Wilms tumors. However, the study of the WT1 gene in cancer cells has revealed an unexpected role as oncogene. Most of the studies were made in leukemia and have shown the biological and clinical importance of WT1 in survival, differentiation and cell proliferation. In the present thesis a total of 274 patients diagnosed with de novo AML in a single center has been studied to analyze in depth the role of the total WT1 expression, the expression of their main 4 isoforms, genetic variations including mutations and the polymorphism rs16754, and expression of miRNA that could potentially be involved in the epigenetic regulation of WT1, in order to clarify the role of WT1 in leukemogenesis. The results of this thesis showed an overexpression of total WT1 in leukemia cells in comparison with its healthy counterpart of CD34 cells from the umbilical cord blood. On the other hand, it seems that it confer a worse survival in patients belonging to FAB M0 subgroup. Referring to the four main WT1 isoforms, the results suggest that such total WT1 overexpression in AML may be due to an increase in the expression of the A, B and C isoforms, together with a relative decrease of isoform D. In addition, the better prognosis observed in patients that over-expressed D isoform presuppose that this isoform might have a protective role in AML, although this result should be confirmed with further functional studies. After the screening of genetic variations of WT1 with the High Resolution Melting tool, the presence of the SNP rs16754 of WT1 in heterozygosis was found in 30% of the patients, consistent with the expected frequency in the Caucasian population. The presence of the minor allele genotype of the SNP (WT1AG) showed no significant difference in terms of survival. In addition, mutations in the WT1 gene were detected in 4% of the series and were associated with an unfavorable prognosis in the multivariate analysis. To find out the microRNAs potentially involved in the epigenetic regulation of WT1, 10 samples of patients selected on the basis of the total WT1 expression (5 with over-expression and 5 with down-expression) were hybridized with miRNA arrays, showing 9 miRNAs with differential expression that were validated by quantitative PCR in patients and controls samples. The validation results suggested that some of the studied microRNAs had different expression patterns and might be involved in the regulation of cell differentiation. On the other hand, an improvement in survival was found for the down-expression of miR-223, miR-425, miR-500 and miR-1307 in the univariate analysis, although its independent prognostic value could not be demonstrated