Estudio de marcadores de enfermedad mínima residual en neuroblastoma y de su posible aplicación clínica

El neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más frecuente en la infancia y el cuarto en frecuencia en el conjunto global de neoplasias infantiles. Su incidencia en nuestro país, según el RNTI oscila entre 8-10 casos por millón de niños y año, por lo que su frecuencia supone alrededor de un 8-10% de todos los tumores en niños. Sin embargo, es el responsable de aproximadamente un 15% del total de muertes provocadas por cáncer pediátrico. La edad media del diagnóstico es de 22 meses, dos tercios de los casos se presentan antes de los 5 años de edad y en un 97% los pacientes tienen menos de 10 años. El tumor es más común en niños que en niñas, siendo el ratio niño/niña aproximadamente 1,3/1. La etiología de este tumor, como en la mayoría de los tumores infantiles, sigue siendo desconocida, sin embargo, en el 1-2% de casos se puede observar una asociación familiar de la enfermedad atribuida a mutaciones germinales en los genes PHOX2B y ALK. En el momento del diagnóstico aproximadamente un 50% de los pacientes debutan con metástasis, siendo las más frecuentes las de la médula ósea. De acuerdo con las recomendaciones del INSS, el estudio de la médula ósea mediante citomorfología convencional es el método aceptado para la detección de células tumorales de neuroblastoma diseminadas. Desde hace unos años se ha estado trabajando en el desarrollo de nuevas aproximaciones más sensibles y específicas para la detección de la Enfermedad Mínima Residual (EMR) y así como garantizar el correcto estadiaje y asesoramiento del riesgo al diagnóstico. Estos métodos se pueden aplicar también para la monitorización de la terapia durante el tratamiento y la detección de las recaídas antes de que las metástasis sean evidentes, pudiendo así intervenir de manera más temprana. Además, el estudio de los productos de leucaféresis para trasplante, podría ser crucial para evitar la reinfusión de células madre contaminadas con células tumorales que pueden iniciar una recaída. Atendiendo a los antecedentes, el presente trabajo se ha centrado en: 1. Desarrollar nuevos marcadores de enfermedad mínima residual específicos para el neuroblastoma que permitan aumentar la sensibilidad y salvar la heterogeneidad tumoral. 2. Evaluar la sensibilidad y especificidad de diferentes marcadores de enfermedad mínima residual. 3. Valorar la utilidad predictiva de la expresión de los diferentes marcadores empleados al diagnóstico en la muestra tumoral. 4. Evaluar del impacto sobre la supervivencia de la detección de los diferentes marcadores en los distintos tipos de tejidos estudiados y momentos de la enfermedad, tanto en pacientes de alto riesgo, como en tumores localizados. Los estudios de detección de EMR se han realizado en muestras de médula ósea, sangre periférica, aféresis y tumores de pacientes de neuroblastoma en todos los estadios de la enfermedad. Las técnicas utilizadas han sido la RT-PCR/Southern Blot para los marcadores MAGE-A1, MAGE-A3, TH y GAGE, la Inmunocitología en el caso de GD2 y la RT-PCR cuantitativa en tiempo real en el caso de TH y DCX. La validación de las diferentes dianas analizadas durante el estudio nos ha permitido proponer la detección de la expresión de DCX como nuevo marcador óptimo para la detección de enfermedad mínima residual en neuroblastoma. Esto se debe a su patrón de expresión específico en neuronas en migración del sistema nervioso central y periférico, junto con su elevada expresión en la práctica totalidad de los tumores estudiados y la ausencia de la misma en muestras de sangre periférica y médula ósea de donantes sanos. Por otra parte, en el caso de la expresión de los genes de la familia GAGE, la expresión observada en una proporción importante de muestras de donantes sanos, junto con los resultados obtenidos en las diferentes muestras y grupos de pacientes con neuroblastoma, nos permite afirmar que estos genes no son útiles para la detección de micrometástasis en este tumor. El análisis de los datos obtenidos mediante las diferentes técnicas y marcadores, han demostrado que es importante utilizar más de un marcador en la detección de células tumorales metastáticas, por la posible heterogeneidad tumoral. En este sentido, aunque la inmunocitología es la única técnica que nos permite el contaje de células tumorales, los resultados obtenidos en los estudios de validación de la técnica de la PCR cuantitativa en tiempo real, junto con la mayor sensibilidad demostrada frente al resto de técnicas utilizadas y el coste efectividad de la misma, nos permiten proponer a la QF-PCR como técnica óptima. Así, proponemos la detección de la expresión de TH y DCX como una combinación adecuada para la detección de EMR en neuroblastoma. Los estudios realizados en tumor, nos revelan que la expresión del gen MAGE-A1 se asocia de forma significativa a una mayor supervivencia y supervivencia libre de eventos de los pacientes, siendo un predictor independiente de otros, como la amplificación del gen NMYC, pero no del estadio tumoral, dada su mayor frecuencia en tumores localizados. El análisis de los datos en pacientes con enfermedad localizada ha permitido demostrar la existencia de células tumorales en médula ósea y en sangre periférica. En estos casos, la detección de enfermedad mínima residual, especialmente la expresión de MAGE-A1 en pacientes estadio 3, podría tener un valor pronóstico adverso. Por otra parte, la detección de la expresión de DCX en el momento de la recaída en este grupo de pacientes, se correlaciona con una menor supervivencia de los mismos. Este fenómeno podría estar relacionado con una mayor agresividad de las células tumorales que expresan este gen, por lo que su valoración en muestras de médula ósea y de sangre periférica podría indicar un subgrupo de pacientes con peor pronóstico que se podrían beneficiar de terapias más intensivas en el tratamiento de dicha recaída. En el caso de los pacientes estadio 4 y alto riesgo, el estudio de EMR nos permitió concluir que la detección de células tumorales mediante inmunocitología con Anti-GD2 en sangre periférica al diagnóstico de este grupo de pacientes se asocia con una menor supervivencia y supervivencia libre de eventos. Por otra parte, la expresión de DCX en MO tras quimioterapia de inducción en pacientes de alto riesgo se asocia significativamente con una peor supervivencia. En el caso de pacientes estadio 4, dicha asociación se observa tanto en la supervivencia global como en la supervivencia libre de eventos. Finalmente, la detección de la expresión de TH y del conjunto de marcadores en médula ósea en la recaída, tanto en el grupo de alto riesgo como en los pacientes estadio 4, se asocia de forma significativa con el fallecimiento de los pacientes. En sangre periférica se observan resultados similares, sin alcanzarse la significatividad, por lo que sería importante confirmar este resultado para un posible protocolo de seguimiento más exhaustivo de la enfermedad mínima residual tras del final del tratamiento, evitando la utilización de técnicas invasivas. En el caso de las aféresis, a pesar del escaso número de muestras analizadas, la detección de células tumorales no parece estar relacionada con una mayor tasa de recaída, por lo que no parece ser un factor determinante de recaída. Como resumen final, en los estudios de EMR en neuroblastoma, sería necesario un esfuerzo coordinado de grupos internacionales, para poder establecer conclusiones más robustas sobre el posible valor del estudio de micrometástasis o la detección de células tumorales en MO, SP o aféresis y de su aplicación en la práctica clínica. De los resultados obtenidos, se podrían beneficiar directamente los pacientes, ya que se podrían establecer grupos de mayor riesgo en función los resultados obtenidos al diagnóstico de la enfermedad, monitorizar y cuantificar la respuesta al tratamiento sobre la enfermedad metastática, detectar aféresis contaminadas con células tumorales o predecir una posible recaída antes de la recaída clínica. En todos los casos, se podrían diseñar protocolos alternativos de tratamiento para intentar aumentar la supervivencia en estos casos