Caracterización genómica del microalga Trebouxia sp. TR9 aislada del liquen Ramalina farinacea (L.) Ach. mediante secuenciación masiva

Los líquenes son complejas entidades simbióticas originadas por asociaciones cíclicas e interacciones positivas de organismos muy diferentes, un hongo heterotrófico y uno o varios “fotobiontes” autótrofos fotosintéticos, tanto algas verdes unicelulares, como cianobaterias o ambos. Además, comunidades específicas de bacterias aparecen como simbiontes obligados de líquenes. En todos los talos del liquen Ramalina farinacea (L.) Ach., coexisten las dos mismas especies de algas Trebouxia (T. jamesii -TR1- y Trebouxia sp. TR9). Esta forma de asociación simbiótica específica y selectiva es interesante como modelo de la coexistencia de dos especies diferentes de Trebouxia dentro de un mismo talo liquénico. Esta coexistencia es probable que sea promovida por diferentes contextos fisiológicos. Trebouxia sp. TR9 muestra respuestas originales que se inducen frente al estrés abiótico y tiene un mejor rendimiento fisiológico que T. jamesii. Estas características pueden ser el reflejo de su mayor capacidad para llevar a cabo ajustes metabólicos clave. Para investigar la base genética de la plasticidad de esta especie de microalga, se ha generado un estudio de las secuencias genómicas de Trebouxia sp. TR9 utilizando NGS. El ADN total obtenido de cultivos de Trebouxia sp. TR9 aislados del liquen Ramalina farinacea fue secuenciado con las tecnologías 454 y Solexa con objeto de analizar su estructura genómica e investigar nuevas secuencias de genes mediante la comparación con las bases de datos existentes de genomas de algas verdes. Como resultado, se han obtenido las secuencias de los genomas cloroplástico, mitocondrial y nuclear de Trebouxia sp. TR9. Los genomas mitocondriales y cloroplásticos han sido anotados de forma manual y se han identificado en ellos un total de 61 y 108 genes, respectivamente. El genoma mitocondrial es de naturaleza circular y tiene un tamaño de 70.070 nt. en algunos de los genes anotados se han localizado 9 intrones de tipo I, algunos de los cuales contienen ORFs que codifican “Homing endonucleases” de la familia LAGLIDADG. El genoma cloroplástico de Trebouxia sp. TR9 es también de naturaleza circular y posee la estructura cuatripartita típica de los cloroplastos de plantas vasculares, las regiones repetidas invertidas o IR incluyen un único gen, el rbcL. El tamaño final del genoma cloroplástico obtenido ha sido de 303.323 nt siendo uno de los mayores tamaños conocidos en el contexto de las algas verdes de la división Chlorophyta. En algunos genes, se han identificado 12 intrones de tipo I, 6 de ellos con ORFs que podrían codificar “Homing endonucleasas” de la familia LAGLIDADG. El genoma nuclear de Trebouxia sp. TR9 ha sido ensamblado con el programa Velvet utilizando diferentes tamaños de K-mer (21-133). El ensamblaje más óptimo del genoma nuclear abarcaba 2.626 "contigs" que tenían una longitud total de 59.121.427 nt junto a un tamaño de “contig” N50 y N95 de 142.866 nt y 21.727 nt, respectivamente. Para comprobar la continuidad del ensamblaje nuclear se ha utilizado el espacio génico calculado con la herramienta CEGMA. El genoma nuclear comprendía un 91 y 97 % del conjunto de 248 CEGs de forma completa y parcial, respectivamente. La anotación del genoma nuclear se basó en la predicción de genes “ab initio” con el programa AUGUSTUS entrenado con los modelos obtenidos anteriormente con el programa CEGMA. Como resultado, se obtuvieron 9.499 posibles modelos génicos, 6.364 fueron anotados con al menos un término de Gene Ontology (GO) y de ellos, 2.249 mostraron un número enzimático asociado. Se han encontrado elementos móviles en el genoma nuclear, la mayoría de ellos son retrotransposones con repeticiones terminales largas (LTR), de los cuales, los más abundantes son de tipo Gypsy/DIRS1 y Ty1/Copia. Se han detectado un total de 10.922 dominios proteicos PFAM presentes en 6.544 modelos proteicos de los que 2.147 y 2.979 son compartidos por todas o por, al menos, una de las especies de microalgas verdes con las que se ha comparado este genoma (Asterochloris sp., Chlorella variabilis, Coccomyxa subellipsoidea y Chlamydomonas reindhartii), respectivamente. Además, se han encontrado 19 motivos PFAM específicos de la división Chlorophyta, 6 motivos propios de las algas liquénicas Trebouxia sp. TR9 y Asterochloris sp y 23 motivos propios de Trebouxia sp. TR9. La identificación de proteínas relacionadas con la asimilación de carbono sugiere que Trebouxia sp. TR9 puede tener mecanismos de concentración de carbono de tipo C3 y C4/CAM. El estudio de enzimas relacionadas con el metabolismo de carbohidratos presentes en los modelos proteicos de Trebouxia sp. TR9 y otras algas de la clase Trebouxiophyceae indica que, entre el 11 y el 12 % de las proteínas totales de estas algas, pertenecían al menos a un clan de las familias de la base de datos “Carbohydrate-Active enZYmes Database” (CAZy). Además, las anotaciones de genes revelaron la existencia de proteínas relacionadas con virus. Los datos obtenidos en esta tesis doctoral no sugieren una reducción dramática del genoma de Trebouxia sp. TR9 que pueda relacionarse a su forma de vida simbiótica. Este trabajo ofrece una visión general de los tres genomas del microalga Trebouxia sp. TR9 y de sus principales características y estructuras, que aportan datos inéditos y relevantes para el análisis de las tendencias evolutivas de las Trebouxiophyceae. Así, p. ej., respecto a otras filogenias realizadas en base a genes cloroplásticos, la realizada aquí con las secuencias de las proteínas codificadas por siete genes del genoma mitocondrial de Trebouxia sp. TR9 y los de 25 especies de algas verdes, han puesto de manifiesto dos nuevas diferencias fundamentales: (i) la monofilia de la clase Trebouxiophyceae y (ii) la posición de la clase Pedinophyceae más relacionada con las Chlorophyceae y Ulvophyceae.Lichens are complex symbiotic entities originated by cyclical associations and positive interactions of very different organisms, a heterotrophic fungus and one or several photosynthetic autotrophs "photobionts", either unicellular green algae, cyanobacteria or both. Also, specific bacterial communities remain obligate lichen symbionts. In the lichen thalli of Ramalina farinacea (L.) Ach., the same two algal Trebouxia species coexist in every thallus (T. jamesii -TR1- and Trebouxia sp. TR9). This specific and selective form of symbiotic association is interesting as a model of the coexistence of two different Trebouxia species within the same lichen thallus. Such coexistence is likely to be promoted by different physiological backgrounds. Trebouxia sp. TR9 shows novel inducible responses against abiotic stress and seems to have a better physiological performance than T. jamesii. These features may reflect its greater capacity to undertake key metabolic adjustments. To investigate the genetic basis of the physiological plasticity of this microalgal species, a survey of the genomic sequences of Trebouxia sp. TR9 by NGS has been generated. The total DNA obtained from cultures of Trebouxia sp. TR9, isolated from the lichen Ramalina farinacea, was sequenced by 454 and Solexa technologies in order to analyze its genome structure as well as to explore new gene sequences by comparing it with available green algae genome databases. As a result, the sequences of the chloroplast, mitochondrial and nuclear genomes of Trebouxia sp. TR9 were produced. Mitochondrial and chloroplast genomes were annotated manually and a total of 61 and 108 genes, respectively, have been identified. The mitochondrial genome is circular and its size is 70,070 bp, 9 type I introns have been detected in several genes; somo of them contains ORFs codifying “Homing endonucleases” of the LAGLIDADG family. The chloroplast genome of Trebouxia sp. TR9 is also circular and shows the typical quadripartite structure of land plant chloroplasts and the IR, or inverted repeat regions, include a single gene, rbcL. The final size of the chloroplast genome was 303,323 pb, this being one of the largest known in the Chlorophyta green algae context. 12 type I introns have been detected; six of them contain ORFs codifying Homing endonucleases of the LAGLIDADG family. The nuclear genome of Trebouxia sp. TR9 has been assembled with Velvet software using different K-mer sizes (21-133). The most optimal assembly comprise 2,626 "contigs" with a total length of 59,121,427 bp, N50 and N95 "contig" length of 142,866 bp and 21,727 bp, respectively. To check the continuity of the nuclear assembly the CEGMA gene space was calculated. The nuclear genome comprised 91% and 97% of the total of 248 complete and incomplete CEGs, respectively. The "ab initio" annotation gene prediction was based on AUGUSTUS software trained with the models previously obtained with CEGMA. 9,499 possible gene models were obtained, 6,364 were annotated showing at least one term of Gene Ontology (GO), and of those 2,249 were associated with an enzyme number. We also found mobile elements in the nuclear genome; most of them were retrotransposons with long terminal repeats (LTR), of which the most abundant were Gypsy / DIRS1 and Ty1 / Copia types. A total of 10,922 PFAM protein domains were present in 6,544 protein models and of those 2,147 and 2,979 were shared by all or at least one of the additional microalgae genomes analyzed (Asterochloris sp., Chlorella variabilis, Coccomyxa subellipsoidea and Chlamydomonas reindhartii), respectively. In addition, 19 Chlorophyta specific PFAM motifs, 6 specific motifs of Trebouxia sp. TR9 and Asterochloris sp lichen algae, and 23 specific motifs of Trebouxia sp. TR9 were found. The identification of proteins involved in carbon uptake suggests that Trebouxia sp. TR9 may possess carbon concentration mechanisms similar to C3 and C4/CAM. The study of carbohydrate metabolism in the protein enzymes models of Trebouxia sp. TR9, and other Trebouxiophyceae algae, point out that between 11% and 12% of the total proteins of these algae fitted to at least one clan of the families of the "Carbohydrate-Active Enzymes" (CAZy) database. Furthermore, gene annotations showed virus-related proteins. No dramatic reductions in the genome of Trebouxia sp. TR9 associated with its symbiotic way of life are suggested by our data. This work provides a first glimpse into the three genomes of the microalga Trebouxia sp. TR9 and a general overview of their main features and structures which may shed light on the evolutionary trends of the Trebouxiophyceae. For instance, the phylogeny obtained using the sequences codified by seven genes of the mitochondrial genome of Trebouxia sp. TR9 and additional ones from 25 species of green algae, revealed two new differences in relation with those obtained using only chloroplast genes: (i) The Trebouxiophyceae are monophyletic and (ii) the Pedinophyceae are more related to Chlorophyceae and Ulvophyceae