Papel de la fosforilación de p27 en la serina 10 en la función endotelial y el remodelado vascular patológico

El supresor tumoral p27 ha sido ampliamente implicado en multitud de procesos patológicos donde ejerce un papel protector debido a su acción antiproliferativa. Particularmente, a nivel cardiovascular, nuestro laboratorio ha demostrado que p27 protege frente al desarrollo de aterosclerosis en modelos murinos gracias a su función anti-proliferativa (1, 2). La regulación de p27 está fuertemente mediada por sus modificaciones postraduccionales, entre las que destaca su fosforilación en la serina 10 (principal modificación que sufre la proteína). Recientemente, nuestro laboratorio ha demostrado que la fosforilación de p27 en su Ser10 protege frente al desarrollo de aterosclerosis avanzada, incrementando la susceptibilidad de los macrófagos para captar lipoproteínas modificadas sin afectar la proliferación celular en la pared arterial (3). Este resultado se suma a recientes estudios que demuestran la participación de esta proteína en otros procesos independientes del control del ciclo celular (4-8) e invita a profundizar en el papel que juega la fosforilación de p27 en serina 10 en el contexto vascular. En este trabajo hemos querido profundizar en los mecanismos por los que dicha fosforilación afecta a la formación de aterosclerosis (centrándonos en sus primeros estadios), así como identificar otros procesos patológicos en el sistema vascular en los que podría intervenir (formación de aneurismas, contractibilidad vascular etc.). Para la consecución de estos objetivos se utilizaron diferentes estrategias experimentales basada en modelos in vitro e in vivo, algunos de las cuales se detallan a continuación. El estudio se ha basado de manera sustancial en la utilización de modelos animales. El más importante fue el ratón p27S10A, el cual expresa una versión mutada de p27 en la que se sustituyó la Serina en posición 10 (susceptible de fosforilación) por una Alanina (residuo incapaz de sufrir dicha modificación). Este ratón nos ha permitido estudiar las consecuencias fisiológicas, celulares y moleculares de un estado desfosforilado de la serina 10 de p27. Con el propósito de estudiar el proceso aterosclerótico nos hemos valido del ratón deficiente en apolipoproteína E, capaz de desarrollar aterosclerosis de manera acelerada en condiciones de dieta hipercolesterolémica. Por otro lado, con el objetivo de analizar las interacciones leucocito-endotelio características de las primeras fases de la enfermedad, hemos recurrido a técnicas de microscopía intravital que han permitido la visualización in vivo de arterias de ratón. Estas técnicas también se emplearon para el estudio de la capacidad contráctil en arterias de pequeño tamaño. Además, estos experimentos se complementaron con estudios ex vivo en vasos de mayor calibre mediante el empleo de un miógrafo de alambre. Por último destacar la utilización del modelo de infusión de AngII en ratones deficientes en apolipoporteina E, para la generación y el estudio de aneurismas aórtico-abdominales. Todos estos ensayos fueron completados con estudios in vitro de células en cultivo y el empleo de técnicas de biología molecular (Western-blot, qPCR, ELISA, etc.). Se observó que la regulación de la fosforilación de p27 en la serina 10 juega un papel muy importante en la homeostasis vascular, particularmente a nivel endotelial. En estudios de aterosclerosis hemos visto que se produce un descenso en el nivel de fosforilación de p27 en serina 10 en aorta y que la ausencia de esta fosforilación promueve la activación endotelial y el posterior reclutamiento leucocitario. Esto es consecuencia de una hiperactivación de la ruta de señalización RhoA-ROCK que desencadena un aumento en la expresión de VCAM-1, molécula de adhesión endotelial. Como consecuencia de estas acciones a nivel celular, el estado defosforilado de p27 promueve in vivo la formación de aterosclerosis desde las primeras etapas de la enfermedad. Profundizando en el estudio del endotelio, se observó que esta fosforilación también modula la regulación del tono vascular. Experimentos tanto ex vivo como in vivo demostraron que la ausencia de dicha fosforilación incrementa la contractilidad vascular de un modo dependiente de endotelio. Este hallazgo se asoció a un aumento de la expresión de la proteína COX-2 en células endoteliales de aorta de ratón. Estudios complementarios demostraron que la inhibición específica de COX-2 era suficiente para que la ausencia de fosforilación de p27 no modificase el patrón contráctil observado en aortas control. Además, observamos que los ratones que carecían de la forma fosforilada de p27 no presentaban hipertensión arterial pero sí mostraron alteraciones en la estructura de la pared vascular. Por último, el incremento de la expresión de COX-2 y la modificación estructural de las arterias debido a la ausencia de fosforilación de p27 en serina 10 se tradujo en un incremento del riesgo a sufrir aneurismas de aorta abdominal. Esta enfermedad, que comparte ciertas características con la aterosclerosis, se desarrolló en mayor grado en ratones p27S10A al compararlos con sus controles silvestres. Del mismo modo, este fenotipo se debió a una mayor actividad de la enzima COX-2 en aorta, hecho que se confirmo con experimentos en los que se bloqueó específicamente la actividad de la enzima. Los resultados obtenidos muestran que la fosforilación de p27 en la serina 10 regula un gran número de procesos implicados en la patología vascular. Por un lado se demostró que la importancia de esta fosforilación en el desarrollo de aterosclerosis no solo se limita a estados avanzados de la misma,como ya se vio en estudios previos (3), sino que, mediante el control de la función endotelial, también es relevante en el inicio del proceso aterosclerótico. Este hallazgo apunta a p27 como una posible diana para la prevención de la aterosclerosis, debido a su papel importante durante todo el proceso patológico. Asimismo, la identificación de esta fosforilación como factor en la regulación de la expresión de COX-2 a nivel endotelial y las consecuencias que de ello se derivaron (mayor predisposición a la formación de aneurismas y aumento de la reactivada vascular) invitan a seguir profundizando en el estudio de esta proteína. Entre los retos aun por afrontar se encontraría sin duda la identificación de las quinasas y/o fosfatasas específicas que regulan el estado fosforilativo de la proteína, así como los estímulos que las inducen, como punto de partida hacia futuras terapias. Bibliografía: 1. Diez-Juan A, Andres V. The growth suppressor p27Kip1 protects against diet-induced atherosclerosis. FASEB J. 2001 September 1, 2001;15(11):1989-95. 2. Diez-Juan A, Perez P, Aracil M, Sancho D, Bernad A, Sanchez-Madrid F, et al. Selective inactivation of p27Kip1 in hematopoietic progenitor cells increases neointimal macrophage proliferation and accelerates atherosclerosis. Blood. 2004 January 1, 2004;103(1):158-61. 3. Fuster JJ, Gonzalez-Navarro H, Vinue A, Molina-Sanchez P, Andres-Manzano MJ, Nakayama KI, et al. Deficient p27 phosphorylation at serine 10 increases macrophage foam cell formation and aggravates atherosclerosis through a proliferation-independent mechanism. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011 Nov;31(11):2455-63. 4. Besson A, Gurian-West M, Schmidt A, Hall A, Roberts JM. p27Kip1 modulates cell migration through the regulation of RhoA activation. Genes Dev. 2004 April 15, 2004;18(8):862-76. 5. Castro C, Diez-Juan A, Cortes MJ, Andres V. Distinct regulation of mitogen-activated protein kinases and p27Kip1 in smooth muscle cells from different vascular beds. A potential role in establishing regional phenotypic variance. J Biol Chem. 2003 Feb 14;278(7):4482-90. 6. Diez-Juan A, Andres V. Coordinate control of proliferation and migration by the p27Kip1/Cyclin-Dependent Kinase/Retinoblastoma pathway in vascular smooth muscle cells and fibroblasts. Circ Res. 2003 March 7, 2003;92(4):402-10. 7. McAllister SS, Becker-Hapak M, Pintucci G, Pagano M, Dowdy SF. Novel p27kip1 C-terminal scatter domain mediates Rac-dependent cell migration independent of cell cycle arrest functions. Mol Cell Biol. 2003 January 1, 2003;23(1):216-28. 8. Pippa R, Espinosa L, Gundem G, Garcia-Escudero R, Dominguez A, Orlando S, et al. p27Kip1 represses transcription by direct interaction with p130/E2F4 at the promoters of target genes. Oncogene. 2012 Sep 20;31(38):4207-20